عزل وتحديد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية المنقولة بالماء والتوصيف الجزيئي لجيناتها المقاومة للمضادات الحيوية
Summary
نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من الماء والتوصيف الجزيئي لجيناتها المقاومة للمضادات الحيوية (ARGs). يوفر استخدام التقنيات القائمة على الثقافة وغير القائمة على الثقافة (التحليل الميتاجينومي) معلومات كاملة حول التنوع البكتيري الكلي والمجموعة الإجمالية ل ARGs المختلفة الموجودة في المياه العذبة من مومباي ، الهند.
Abstract
يعد تطور وانتشار مقاومة المضادات الحيوية (AR) من خلال الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بأجسام المياه العذبة مصدر قلق صحي عالمي كبير. في هذه الدراسة ، تم جمع عينات المياه العذبة وتحليلها فيما يتعلق بالتنوع البكتيري الكلي وجينات AR (ARGs) باستخدام كل من التقنيات التقليدية القائمة على الثقافة ونهج metagenomic عالي الإنتاجية المستقل عن الزراعة. يقدم هذا البحث بروتوكولا منهجيا لتعداد البكتيريا الكلية والمقاومة للمضادات الحيوية من عينات المياه العذبة وتحديد مقاومة النمط الظاهري والوراثي في العزلات القابلة للزراعة. علاوة على ذلك ، أبلغنا عن استخدام التحليل الميتاجينومي الكامل للحمض النووي الميتاجينومي الكلي المستخرج من عينة المياه العذبة لتحديد التنوع البكتيري الكلي ، بما في ذلك البكتيريا غير القابلة للزراعة ، وتحديد المجموعة الإجمالية لمختلف ARGs (المقاومة) في الجسم المائي. باتباع هذه البروتوكولات التفصيلية ، لاحظنا حمولة بكتيريا عالية المقاومة للمضادات الحيوية في نطاق 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL. كانت معظم العزلات مقاومة للمضادات الحيوية المتعددة التي تم اختبارها ، بما في ذلك سيفوتاكسيم ، والأمبيسلين ، والليفوفلوكساسين ، والكلورامفينيكول ، والسيفترياكسون ، والجنتاميسين ، والنيومايسين ، والتريميثوبريم ، وسيبروفلوكساسين ، مع مؤشرات مقاومة متعددة للمضادات الحيوية (MAR) تبلغ ≥0.2 ، مما يشير إلى مستويات عالية من المقاومة في العزلات. حدد تسلسل 16S rRNA مسببات الأمراض البشرية المحتملة ، مثل Klebsiella pneumoniae ، والبكتيريا الانتهازية ، مثل Comamonas spp. ، Micrococcus spp. ، Arthrobacter spp. ، و Aeromonas spp. أظهر التوصيف الجزيئي للعزلات وجود العديد من ARGs ، مثل blaTEM و blaCTX-M (β-lactams) و aadA و aac (6 ‘) -Ib (أمينوغليكوزيدات) و dfr1 (trimethoprims) ، وهو ما تم تأكيده أيضا من خلال تحليل الحمض النووي الميتاجينومي بأكمله. كما تم الكشف عن ارتفاع معدل انتشار ARGs الأخرى المشفرة لمضخات تدفق المضادات الحيوية – mtrA و macB و mdtA و acrD و β-lactamases-SMB-1 و VIM-20 و ccrA و ampC و blaZ وجين الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز catB10 ، وجين مقاومة الريفامبيسين rphB- في الحمض النووي الميتاجينومي. بمساعدة البروتوكولات التي تمت مناقشتها في هذه الدراسة ، أكدنا وجود بكتيريا MAR المنقولة بالماء مع سمات النمط الظاهري والوراثي AR المتنوعة. وبالتالي ، يمكن استخدام تحليل الحمض النووي الميتاجينومي الكامل كتقنية تكميلية للتقنيات التقليدية القائمة على الثقافة لتحديد الحالة العامة للواقع المعزز لجسم مائي.
Introduction
تم تحديد مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) باعتبارها واحدة من أكثر المشاكل العالمية إلحاحا. يعد التطور السريع لمقاومة مضادات الميكروبات وانتشارها في جميع أنحاء العالم أحد أكبر التهديدات لصحة الإنسان والاقتصاد العالمي من حيث التكاليف الصحية المرتبطة بها1. أدى الإفراط في استخدام المضادات الحيوية وإساءة استخدامها إلى زيادة في الواقع المعزز. وقد تم تسليط الضوء على ذلك من خلال جائحة COVID-19 ، حيث تعرض علاج العدوى الثانوية المصاحبة ، في كثير من الحالات ، للخطر بشكل كبير بسبب مقاومة مضادات الميكروبات في المرضى المصابين2. إلى جانب الاستخدام المباشر / إساءة استخدام المضادات الحيوية من قبل البشر ، فإن الإفراط في استخدام المضادات الحيوية وإساءة استخدامها في الزراعة وتربية الحيوانات وتصريفها بشكل غير مناسب في البيئة ، بما في ذلك المسطحات المائية ، هي مصدر قلق كبير3. إن ظهور سمات مقاومة جديدة ومقاومة للأدوية المتعددة في البكتيريا يسلط الضوء بشكل عاجل على الحاجة إلى فهم أفضل للعوامل التي تؤدي إلى تطوير AR ونشره. يمكن للبكتيريا المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية ، والتي غالبا ما تحمل جينات AR متعددة (ARGs) على العناصر الجينية المتنقلة مثل البلازميدات ، نقل جينات المقاومة هذه إلى الكائنات الحية الدقيقة غير المقاومة ، بما في ذلك مسببات الأمراض البشرية المحتملة ، مما يؤدي إلى ظهور الجراثيم الخارقة التي لا يمكن علاجها حتى بالمضادات الحيوية كملاذ أخير4. يمكن لهذه البكتيريا المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية ، إذا كانت موجودة في النظم الإيكولوجية للمياه ، أن تدخل الأمعاء البشرية مباشرة عن طريق استهلاك الأطعمة الملوثة القائمة على الماء مثل الأسماك وسرطان البحر والرخويات. أظهرت الدراسات السابقة أن انتشار بكتيريا AR في أنظمة المياه التي تحدث بشكل طبيعي يمكن أن يصل أيضا إلى إمدادات المياه الأخرى ، بما في ذلك مياه الشرب ، وبالتالي يمكن أن يدخل السلسلة الغذائية البشرية5،6،7.
الهدف من هذه الدراسة هو توفير بروتوكول شامل باستخدام مزيج من التقنيات القائمة على الثقافة وغير القائمة على الثقافة (التحليل الميتاجينومي الكامل) للحصول على معلومات كاملة حول التنوع البكتيري الكلي والمجموعة الإجمالية لمختلف ARGs الموجودة في جسم مائي في مومباي ، الهند. تقليديا ، تم استخدام التقنيات القائمة على الثقافة لدراسة التنوع البكتيري في المسطحات المائية. نظرا لأن الكائنات الحية الدقيقة القابلة للزراعة لا تشكل سوى نسبة صغيرة من إجمالي الكائنات الحية الدقيقة في أي مكان ، للحصول على فهم أفضل للحالة العامة للتنوع البكتيري والسمات المقاومة المختلفة السائدة في أي عينة ، يجب استخدام تقنيات مختلفة قائمة على الثقافة ومستقلة عن الثقافة جنبا إلى جنب. إحدى هذه التقنيات القوية والموثوقة المستقلة عن الثقافة هي تحليل الحمض النووي الميتاجينومي الكامل. تم استخدام هذه الطريقة عالية الإنتاجية بنجاح في دراسات مختلفة حول التنوع البكتيري أو التعليقات التوضيحية الوظيفية لمختلف ARGs 8,9. تستخدم هذه التقنية الميتاجينوم (المادة الوراثية الكلية في العينة) كمادة أولية لتحليلات مختلفة ، وبالتالي فهي مستقلة عن الثقافة. يمكن استخدام البروتوكولات في هذه الدراسة لتحليل الحمض النووي الميتاجينومي الكامل للحصول على معلومات حول التنوع البكتيري الكلي ومختلف ARGs (المقاومة) في عينات المياه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يلعب جمع العينات ومعالجتها دورا مهما وقد يؤثر على نتائج الدراسة وتفسيرها. ومن ثم ، لاستبعاد التباين في العينات ، من المهم إجراء أخذ العينات في مواقع متعددة من جسم المياه العذبة قيد الدراسة. يمكن أن يؤدي الحفاظ على الظروف البيئية المعقمة المناسبة عند التعامل مع هذه العينات إلى منع التلوث. ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح المالية من قسم العلوم والتكنولوجيا – تعزيز البحث الجامعي والتميز العلمي (DST-PURSE) مخطط جامعة مومباي. عملت ديفيكا غاديغاونكار كزميلة مشروع في إطار المخطط. تم الاعتراف بالمساعدة الفنية التي قدمها Harshali Shinde ، زميل باحث أول في إطار مشروع مجلس أبحاث العلوم والتكنولوجيا والعلوم والهندسة (DST-SERB): CRG / 2018 / 003624.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
