Isolement et identification de bactéries résistantes aux antibiotiques d’origine hydrique et caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et l’identification de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir de l’eau et la caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques (ARG). L’utilisation de techniques basées sur la culture et non basées sur la culture (analyse métagénomique) fournit des informations complètes sur la diversité bactérienne totale et le pool total de différents ARG présents dans les eaux douces de Mumbai, en Inde.
Abstract
Le développement et la propagation de la résistance aux antibiotiques (RA) par le microbiote associé aux masses d’eau douce est un problème de santé mondial majeur. Dans la présente étude, des échantillons d’eau douce ont été prélevés et analysés en fonction de la diversité bactérienne totale et des gènes AR (ARG) à l’aide de techniques conventionnelles basées sur la culture et d’une approche métagénomique indépendante de la culture à haut débit. Cet article présente un protocole systématique pour le dénombrement des bactéries cultivables totales et résistantes aux antibiotiques à partir d’échantillons d’eau douce et la détermination de la résistance phénotypique et génotypique dans les isolats cultivables. En outre, nous signalons l’utilisation de l’analyse métagénomique complète de l’ADN métagénomique total extrait de l’échantillon d’eau douce pour l’identification de la diversité bactérienne globale, y compris les bactéries non cultivables, et l’identification du pool total de différents ARG (résistome) dans le plan d’eau. En suivant ces protocoles détaillés, nous avons observé une charge bactérienne élevée résistante aux antibiotiques de l’ordre de 9,6 × 10 5-1,2 × 109 UFC / mL. La plupart des isolats étaient résistants aux multiples antibiotiques testés, y compris la céfotaxime, l’ampicilline, la lévofloxacine, le chloramphénicol, la ceftriaxone, la gentamicine, la néomycine, le triméthoprime et la ciprofloxacine, avec des indices de résistance multiple aux antibiotiques (PMA) de ≥0,2, indiquant des niveaux élevés de résistance dans les isolats. Le séquençage de l’ARNr 16S a identifié des agents pathogènes humains potentiels, tels que Klebsiella pneumoniae, et des bactéries opportunistes, telles que Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. et Aeromonas spp. La caractérisation moléculaire des isolats a montré la présence de divers ARG, tels que blaTEM, blaCTX-M (β-lactamines), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglycosides) et dfr1 (triméthoprimes), ce qui a également été confirmé par l’analyse de l’ADN métagénomique complet. Une prévalence élevée d’autres ARG codant pour les pompes à efflux d’antibiotiques – mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, le gène de la chloramphénicol acétyltransférase catB10 et le gène de résistance à la rifampicine rphB – a également été détectée dans l’ADN métagénomique. À l’aide des protocoles discutés dans cette étude, nous avons confirmé la présence de bactéries MAR d’origine hydrique présentant divers traits phénotypiques et génotypiques de l’AR. Ainsi, l’analyse de l’ADN métagénomique entier peut être utilisée comme technique complémentaire aux techniques conventionnelles basées sur la culture pour déterminer l’état global de la RA d’un plan d’eau.
Introduction
La résistance aux antimicrobiens (RAM) a été identifiée comme l’un des problèmes mondiaux les plus urgents. L’évolution rapide de la RAM et sa propagation mondiale constituent l’une des plus grandes menaces pour la santé humaine et l’économie mondiale en termes de coûts sanitaires qui y sont associés1. La surutilisation et la mauvaise utilisation des antibiotiques ont entraîné une augmentation de l’AR. Cela a été mis en évidence par la pandémie de COVID-19, au cours de laquelle le traitement des infections secondaires associées, dans de nombreux cas, a été considérablement compromis en raison de la RAM chez les patients touchés2. Outre l’utilisation directe ou abusive d’antibiotiques par l’homme, la surutilisation et la mauvaise utilisation des antibiotiques dans l’agriculture et l’élevage et leur rejet inapproprié dans l’environnement, y compris les masses d’eau, constituent une préoccupation majeure3. L’augmentation de nouveaux caractères de résistance et de multirésistance chez les bactéries souligne de toute urgence la nécessité de mieux comprendre les facteurs conduisant au développement de l’AR et à sa dissémination. De multiples bactéries résistantes aux antibiotiques, qui portent souvent plusieurs gènes AR (ARG) sur des éléments génétiques mobiles tels que les plasmides, peuvent transférer ces gènes de résistance à des microorganismes non résistants, y compris des agents pathogènes humains potentiels, conduisant ainsi à l’émergence de superbactéries qui ne peuvent être traitées même avec des antibiotiques de dernier recours4. Ces multiples bactéries résistantes aux antibiotiques, si elles sont présentes dans les écosystèmes aquatiques, peuvent pénétrer directement dans l’intestin humain via la consommation d’aliments contaminés à base d’eau tels que le poisson, les crabes et les mollusques. Des études antérieures ont montré que la propagation des bactéries AR dans les systèmes d’eau naturels peut également atteindre d’autres sources d’approvisionnement en eau, y compris l’eau potable, et, par conséquent, peut entrer dans la chaîne alimentaire humaine 5,6,7.
L’objectif de la présente étude est de fournir un protocole complet utilisant une combinaison de techniques basées sur la culture et non basées sur la culture (analyse métagénomique complète) pour obtenir des informations complètes sur la diversité bactérienne totale et le pool total de différents ARG présents dans un plan d’eau à Mumbai, en Inde. Classiquement, des techniques basées sur la culture ont été utilisées pour étudier la diversité bactérienne dans les plans d’eau. Étant donné que les micro-organismes cultivables ne constituent qu’un faible pourcentage du microbiote total dans n’importe quelle niche, pour mieux comprendre l’état général de la diversité bactérienne et les divers caractères de résistance prévalent dans tout échantillon, diverses techniques basées sur la culture et indépendantes de la culture doivent être utilisées en tandem. L’une de ces techniques robustes et fiables indépendantes de la culture est l’analyse de l’ADN métagénomique entier. Cette méthode à haut débit a été utilisée avec succès dans diverses études sur la diversité bactérienne ou les annotations fonctionnelles de divers ARG 8,9. Cette technique utilise le métagénome (le matériel génétique total d’un échantillon) comme matériau de départ pour diverses analyses et, par conséquent, est indépendante de la culture. Les protocoles de la présente étude peuvent être utilisés pour l’analyse de l’ADN métagénomique entier afin d’obtenir des informations sur la diversité bactérienne totale et divers ARG (résistomes) dans les échantillons d’eau.
Protocol
Representative Results
Discussion
La collecte et le traitement des échantillons jouent un rôle important et peuvent avoir une incidence sur les résultats et l’interprétation de l’étude. Par conséquent, pour exclure la variabilité des échantillons, il est important d’effectuer un échantillonnage à plusieurs endroits de la masse d’eau douce étudiée. Le maintien de conditions environnementales aseptiques appropriées lors de la manipulation de tels échantillons peut prévenir la contamination. En outre, pour éviter toute modification d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement soutenu par des subventions financières du programme DST-PURSE (Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence) de l’Université de Mumbai. Devika Ghadigaonkar a travaillé en tant que Project Fellow dans le cadre de ce programme. L’aide technique fournie par Harshali Shinde, chercheur principal au sein du Conseil de recherche en sciences et en génie du Département des sciences et de la technologie (DST-SERB) Projet no: CRG/2018/003624, est reconnue.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
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