Выделение и идентификация бактерий, устойчивых к антибиотикам, передающихся через воду, и молекулярная характеристика их генов устойчивости к антибиотикам
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол выделения и идентификации устойчивых к антибиотикам бактерий из воды и молекулярную характеристику их генов устойчивости к антибиотикам (ARG). Использование методов, основанных на культурах и не основанных на культурах (метагеномный анализ), дает полную информацию об общем бактериальном разнообразии и общем пуле различных ARG, присутствующих в пресных водах из Мумбаи, Индия.
Abstract
Развитие и распространение устойчивости к антибиотикам (АР) через микробиоту, связанную с пресноводными водоемами, является серьезной глобальной проблемой здравоохранения. В настоящем исследовании образцы пресной воды были собраны и проанализированы в отношении общего бактериального разнообразия и генов AR (ARG) с использованием как традиционных методов, основанных на культурах, так и метагеномного подхода, независимого от культуры. В данной работе представлен систематический протокол перечисления общих и устойчивых к антибиотикам культивируемых бактерий из образцов пресной воды и определения фенотипической и генотипической резистентности в культивируемых изолятах. Кроме того, мы сообщаем об использовании полного метагеномного анализа общей метагеномной ДНК, извлеченной из образца пресной воды, для идентификации общего бактериального разнообразия, включая некультивируемые бактерии, и идентификации общего пула различных ARG (резистома) в водном объекте. Следуя этим подробным протоколам, мы наблюдали высокую устойчивую к антибиотикам бактериальную нагрузку в диапазоне 9,6 × 10 5-1,2 × 109 КОЕ/мл. Большинство изолятов были устойчивы к множественным протестированным антибиотикам, включая цефотаксим, ампициллин, левофлоксацин, хлорамфеникол, цефтриаксон, гентамицин, неомицин, триметоприм и ципрофлоксацин, с индексами множественной устойчивости к антибиотикам (MAR) ≥0,2, что указывает на высокие уровни резистентности в изолятах. Секвенирование 16S рРНК выявило потенциальные патогены человека, такие как Klebsiella pneumoniae, и оппортунистические бактерии, такие как Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. и Aeromonas spp. Молекулярная характеристика изолятов показала наличие различных ARG, таких как blaTEM, blaCTX-M (β-лактамы), aadA, aac (6′)-Ib (аминогликозиды) и dfr1 (триметопримы), что также было подтверждено всем метагеномным анализом ДНК. В метагеномной ДНК также была обнаружена высокая распространенность других АРГ, кодирующих для насосов оттока антибиотиков – mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, гена хлорамфениколацетилтрансферазы catB10 и гена устойчивости к рифампицину rphB-. С помощью протоколов, обсуждаемых в этом исследовании, мы подтвердили наличие передаваемых через воду бактерий MAR с различными фенотипическими и генотипическими признаками AR. Таким образом, весь метагеномный анализ ДНК может быть использован в качестве дополнительного метода к традиционным методам, основанным на культурах, для определения общего статуса AR водного объекта.
Introduction
Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) была определена в качестве одной из наиболее актуальных глобальных проблем. Быстрая эволюция УПП и его распространение во всем мире являются одной из самых больших угроз здоровью человека и мировой экономике с точки зрения связанных с ним расходов наздравоохранение1. Чрезмерное и неправильное использование антибиотиков привело к увеличению AR. Это было подчеркнуто пандемией COVID-19, во время которой лечение ассоциированных вторичных инфекций во многих случаях было чрезвычайно скомпрометировано из-за УПП у пострадавших пациентов2. Помимо прямого использования/неправильного использования антибиотиков людьми, серьезнойпроблемой является чрезмерное и неправильное использование антибиотиков в сельском хозяйстве и животноводстве и их ненадлежащий сброс в окружающую среду, включая водные объекты3. Появление новых признаков резистентности и множественной лекарственной устойчивости у бактерий настоятельно подчеркивает необходимость лучшего понимания факторов, ведущих к развитию АР и его распространению. Множественные устойчивые к антибиотикам бактерии, которые часто несут несколько генов AR (ARG) на мобильных генетических элементах, таких как плазмиды, могут передавать эти гены устойчивости нерезистентным микроорганизмам, включая потенциальные патогены человека, что приводит к появлению супербактерий, которые не поддаются лечению даже антибиотиками последней инстанции4. Эти множественные устойчивые к антибиотикам бактерии, если они присутствуют в водных экосистемах, могут непосредственно проникать в кишечник человека через потребление загрязненных продуктов на водной основе, таких как рыба, крабы и моллюски. Предыдущие исследования показали, что распространение бактерий AR в естественных водных системах может также достигать других источников воды, включая питьевую воду, и, таким образом, может попасть в пищевую цепь человека 5,6,7.
Целью настоящего исследования является предоставление всеобъемлющего протокола с использованием комбинации методов, основанных на культурах и не основанных на культурах (весь метагеномный анализ), для получения полной информации об общем бактериальном разнообразии и общем пуле различных ARG, присутствующих в водном объекте в Мумбаи, Индия. Традиционно для изучения бактериального разнообразия в водоемах используются методы, основанные на культурах. Поскольку культивируемые микроорганизмы составляют лишь небольшой процент от общей микробиоты в любой нише, чтобы лучше понять общее состояние бактериального разнообразия и различные устойчивые признаки, преобладающие в любом образце, необходимо использовать различные методы, основанные на культуре и независимые от культуры методы. Одним из таких надежных и надежных методов, не зависящих от культуры, является анализ всей метагеномной ДНК. Этот высокопроизводительный метод был успешно использован в различных исследованиях бактериального разнообразия или функциональных аннотаций различных ARG 8,9. Этот метод использует метагеном (общий генетический материал в образце) в качестве исходного материала для различных анализов и, следовательно, не зависит от культуры. Протоколы в настоящем исследовании могут быть использованы для анализа всей метагеномной ДНК для получения информации об общем бактериальном разнообразии и различных ARG (резистоме) в образцах воды.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сбор и обработка образцов играют важную роль и могут повлиять на результаты и интерпретацию исследования. Следовательно, чтобы исключить изменчивость проб, важно проводить отбор проб в нескольких местах исследуемого пресноводного водоема. Поддержание надлежащих асептических услови?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана финансовыми грантами Департамента науки и техники – Содействие университетским исследованиям и научному совершенству (DST-PURSE) Схемы Университета Мумбаи. Девика Гадигаонкар работала в качестве стипендиата проекта по этой схеме. Техническая помощь, предоставленная Харшали Шинде, старшим научным сотрудником Департамента науки и техники, науки и инженерных исследований (DST-SERB) Проект No: CRG/2018/003624, приветствуется.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
