בידוד וזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה במים ואפיון מולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם
Summary
במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ממים ולאפיון המולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם (ARGs). השימוש בטכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי) מספק מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים במים מתוקים ממומבאי, הודו.
Abstract
הפיתוח וההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה (AR) באמצעות מיקרוביוטה הקשורה לגופי מים מתוקים הוא דאגה בריאותית עולמית מרכזית. במחקר הנוכחי, דגימות מים מתוקים נאספו ונותחו ביחס למגוון החיידקים הכולל ולגנים של AR (ARGs) תוך שימוש הן בטכניקות קונבנציונליות מבוססות תרבית והן בגישה מטגנומית בלתי תלויה בתרבית בתפוקה גבוהה. מאמר זה מציג פרוטוקול שיטתי לספירה של החיידקים הכוללים והעמידים לאנטיביוטיקה מדגימות מים מתוקים ולקביעת עמידות פנוטיפית וגנוטיפית במבודדים הניתנים לתרבות. יתר על כן, אנו מדווחים על שימוש באנליזה מטא-גנומית שלמה של סך הדנ”א המטגנומי המופק מדגימת המים המתוקים לצורך זיהוי מגוון החיידקים הכולל, כולל חיידקים שאינם ניתנים לתרבות, וזיהוי המאגר הכולל של ARGs שונים (התנגדות) בגוף המים. בעקבות הפרוטוקולים המפורטים האלה, ראינו עומס חיידקים גבוה עמיד לאנטיביוטיקה בטווח של 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU/mL. רוב המבודדים היו עמידים לאנטיביוטיקה הנפוצה שנבדקה, כולל cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, ו ciprofloxacin, עם מספר אינדקסים של עמידות לאנטיביוטיקה (MAR) של ≥0.2, מה שמעיד על רמות גבוהות של עמידות בבידודים. ריצוף 16S rRNA זיהה פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, כגון דלקת ריאות קלבסיאלה, וחיידקים אופורטוניסטיים, כגון Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., ו- Aeromonas spp. האפיון המולקולרי של המבודדים הראה נוכחות של ARGs שונים, כגון blaTEM, blaCTX-M (β-לקטאמים), aadA, aac (6′)-Ib (אמינוגליקוזידים) ו-dfr1 (טרימתופרימים), אשר אושרה גם על ידי ניתוח הדנ”א המטגנומי כולו. שכיחות גבוהה של קידוד ARGs אחרים עבור משאבות שטף אנטיביוטיקה-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, הגן כלורמפניקול אצטילטרנספראז catB10, ואת גן עמידות rifampicin rphB-זוהה גם בדנ”א המטגנומי. בעזרת הפרוטוקולים שנדונו במחקר זה, אישרנו את נוכחותם של חיידקי MAR הנישאים במים עם תכונות פנוטיפיות וגנוטיפיות מגוונות של AR. לפיכך, ניתוח דנ”א מטגנומי שלם יכול לשמש כטכניקה משלימה לטכניקות קונבנציונליות המבוססות על תרביות כדי לקבוע את מצב ה-AR הכולל של גוף מים.
Introduction
עמידות מיקרוביאלית (AMR) זוהתה כאחת הבעיות העולמיות הדחופות ביותר. ההתפתחות המהירה של AMR והתפשטותו העולמית הם אחד האיומים הגדולים ביותר על בריאות האדם ועל הכלכלה העולמית במונחים של עלויות הבריאות הכרוכות בו1. שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה הובילו לעלייה ב-AR. זה הודגש על ידי מגיפת COVID-19, שבמהלכה הטיפול בזיהומים משניים הקשורים, במקרים רבים, נפגע מאוד בגלל AMR בחולים שנפגעו2. מלבד השימוש הישיר/שימוש לרעה באנטיביוטיקה על ידי בני אדם, שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה בחקלאות ובגידול בעלי חיים והזרמתן הבלתי הולמת לסביבה, כולל גופי מים, הם דאגה מרכזית3. עלייתן של תכונות עמידות חדשות ועמידות רב-ממדית בחיידקים מדגישה בדחיפות את הצורך בהבנה טובה יותר של הגורמים המובילים להתפתחות AR והפצתו. חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מרובים, שלעתים קרובות נושאים גנים מרובים של AR (ARGs) על אלמנטים גנטיים ניידים כגון פלסמידים, יכולים להעביר את גני העמידות האלה למיקרואורגניזמים שאינם עמידים, כולל פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, ובכך להוביל להופעתם של חיידקי-על שאינם ניתנים לריפוי אפילו עם אנטיביוטיקה של מוצא אחרון4. החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה המרובים האלה, אם הם נמצאים במערכות אקולוגיות של מים, יכולים להיכנס ישירות למעי האנושי באמצעות צריכת מזונות מזוהמים על בסיס מים, כגון דגים, סרטנים ורכיכות. מחקרים קודמים הראו כי התפשטות חיידקי AR במערכות מים טבעיות יכולה להגיע גם לאספקת מים אחרת, כולל מי שתייה, ובכך יכולה להיכנס לשרשרת המזון האנושית 5,6,7.
מטרת המחקר הנוכחי היא לספק פרוטוקול מקיף תוך שימוש בשילוב של טכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי שלם) כדי לקבל מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים בגוף מים במומבאי, הודו. באופן קונבנציונלי, נעשה שימוש בטכניקות מבוססות תרבית כדי לחקור את מגוון החיידקים בגופי מים. מכיוון שמיקרואורגניזמים תרבותיים מהווים רק אחוז קטן מכלל המיקרוביוטה בכל נישה, כדי להבין טוב יותר את המצב הכללי של מגוון החיידקים ואת תכונות העמידות השונות הנפוצות בכל דגימה, יש להשתמש בטכניקות שונות המבוססות על תרבית ובלתי תלויות בתרבית במקביל. טכניקה אחת חזקה ואמינה כזו, שאינה תלויה בתרבות, היא ניתוח דנ”א מטגנומי שלם. שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה שימשה בהצלחה במחקרים שונים על מגוון חיידקים או על ביאורים פונקציונליים של ARGsשונים 8,9. טכניקה זו משתמשת במטגנום (החומר הגנטי הכולל בדגימה) כחומר המוצא לניתוחים שונים, ולכן היא בלתי תלויה בתרבית. הפרוטוקולים במחקר הנוכחי יכולים לשמש לניתוח דנ”א מטגנומי שלם כדי לקבל מידע על מגוון החיידקים הכולל ועל ARGs (התנגדות) שונים בדגימות מים.
Protocol
Representative Results
Discussion
איסוף הדגימות ועיבודן ממלאים תפקיד משמעותי ועשויים להשפיע על התוצאות והפרשנות של המחקר. לפיכך, כדי לשלול שונות בדגימות, חשוב לבצע דיגום במספר מוקדים של גוף המים המתוקים הנחקרים. שמירה על תנאי סביבה אספטיים נאותים בעת טיפול בדגימות כאלה יכולה למנוע זיהום. יתר על כן, כדי למנוע שינויים בהרכב …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענקים כספיים מהמחלקה למדע וטכנולוגיה – קידום מחקר אוניברסיטאי ומצוינות מדעית (DST-PURSE) של אוניברסיטת מומבאי. דוויקה גדיגאונקר עבדה כעמיתת פרויקט במסגרת התוכנית. העזרה הטכנית שניתנה על ידי Harshali Shinde, עמית מחקר בכיר תחת המחלקה למדע וטכנולוגיה-מדע והנדסה מחקר המועצה למחקר (DST-SERB) פרויקט מספר: CRG/2018/003624, היא מוכרת.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
