Isolatie en identificatie van watergedragen antibioticaresistente bacteriën en moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en identificatie van antibioticaresistente bacteriën uit water en de moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen (ARGs). Het gebruik van op cultuur gebaseerde en niet-cultuurgebaseerde (metagenomische analyse) technieken biedt volledige informatie over de totale bacteriële diversiteit en de totale pool van verschillende ARGs aanwezig in zoet water uit Mumbai, India.
Abstract
De ontwikkeling en verspreiding van antibioticaresistentie (AR) via microbiota geassocieerd met zoetwaterlichamen is een groot wereldwijd gezondheidsprobleem. In de huidige studie werden zoetwatermonsters verzameld en geanalyseerd met betrekking tot de totale bacteriële diversiteit en AR-genen (ARGs) met behulp van zowel conventionele op cultuur gebaseerde technieken als een high-throughput cultuuronafhankelijke metagenomische benadering. Dit artikel presenteert een systematisch protocol voor de inventarisatie van de totale en antibioticaresistente kweekbare bacteriën uit zoetwatermonsters en de bepaling van fenotypische en genotypische resistentie in de kweekbare isolaten. Verder rapporteren we het gebruik van hele metagenomische analyse van het totale metagenomische DNA geëxtraheerd uit het zoetwatermonster voor de identificatie van de algehele bacteriële diversiteit, inclusief niet-kweekbare bacteriën, en de identificatie van de totale pool van verschillende ARGs (resistoom) in het waterlichaam. Volgens deze gedetailleerde protocollen hebben we een hoge antibioticaresistente bacteriebelasting waargenomen in het bereik van 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU / ml. De meeste isolaten waren resistent tegen de meerdere geteste antibiotica, waaronder cefotaxime, ampicilline, levofloxacine, chlooramfenicol, ceftriaxon, gentamicine, neomycine, trimethoprim en ciprofloxacine, met meerdere antibioticaresistentie (MAR) -indexen van ≥0,2, wat wijst op hoge niveaus van resistentie in de isolaten. De 16S rRNA-sequencing identificeerde potentiële menselijke pathogenen, zoals Klebsiella pneumoniae, en opportunistische bacteriën, zoals Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. en Aeromonas spp. De moleculaire karakterisering van de isolaten toonde de aanwezigheid van verschillende ARGs, zoals blaTEM, blaCTX-M (β-lactams), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglycosiden) en dfr1 (trimethoprims), wat ook werd bevestigd door de hele metagenomische DNA-analyse. Een hoge prevalentie van andere ARGs die coderen voor antibioticum effluxpompen-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, het chlooramfenicol acetyltransferase gen catB10 en het rifampicineresistentiegen rphB- werd ook gedetecteerd in het metagenomisch DNA. Met behulp van de protocollen die in deze studie zijn besproken, hebben we de aanwezigheid van watergedragen MAR-bacteriën met verschillende AR-fenotypische en genotypische eigenschappen bevestigd. Zo kan hele metagenomische DNA-analyse worden gebruikt als een aanvullende techniek voor conventionele op cultuur gebaseerde technieken om de algehele AR-status van een waterlichaam te bepalen.
Introduction
Antimicrobiële resistentie (AMR) is geïdentificeerd als een van de meest urgente wereldwijde problemen. De snelle ontwikkeling van AMR en de wereldwijde verspreiding ervan vormen een van de grootste bedreigingen voor de menselijke gezondheid en de wereldeconomie in termen van de gezondheidskosten die ermee gepaard gaan1. Het overmatig gebruik en misbruik van antibiotica hebben geleid tot een toename van AR. Dit is benadrukt door de COVID-19-pandemie, waarbij de behandeling van geassocieerde secundaire infecties in veel gevallen enorm werd aangetast als gevolg van AMR bij de getroffen patiënten2. Naast het directe gebruik/misbruik van antibiotica door mensen, zijn het overmatig gebruik en misbruik van antibiotica in de landbouw en de veehouderij en hun ongepaste lozing in het milieu, met inbegrip van waterlichamen, een grote zorg3. De opkomst van nieuwe resistentiekenmerken en multidrugresistentie bij bacteriën benadrukt dringend de behoefte aan een beter begrip van de factoren die leiden tot de ontwikkeling van AR en de verspreiding ervan. Meerdere antibioticaresistente bacteriën, die vaak meerdere AR-genen (ARG’s) dragen op mobiele genetische elementen zoals plasmiden, kunnen deze resistentiegenen overbrengen naar niet-resistente micro-organismen, waaronder potentiële menselijke pathogenen, wat leidt tot de opkomst van superbacteriën die onbehandelbaar zijn met zelfs laatste redmiddel antibiotica4. Deze meerdere antibioticaresistente bacteriën, indien aanwezig in waterecosystemen, kunnen rechtstreeks de menselijke darm binnendringen via de consumptie van besmet voedsel op waterbasis, zoals vissen, krabben en weekdieren. Eerdere studies hebben aangetoond dat de verspreiding van AR-bacteriën in natuurlijk voorkomende watersystemen ook andere watervoorraden kan bereiken, waaronder drinkwater, en dus in de menselijke voedselketen kan terechtkomen 5,6,7.
Het doel van deze studie is om een uitgebreid protocol te bieden met behulp van een combinatie van op cultuur gebaseerde en niet-op cultuur gebaseerde (hele metagenomische analyse) technieken om volledige informatie te verkrijgen over de totale bacteriële diversiteit en de totale pool van verschillende ARGs aanwezig in een waterlichaam in Mumbai, India. Conventioneel zijn op cultuur gebaseerde technieken gebruikt om de bacteriële diversiteit in waterlichamen te bestuderen. Aangezien kweekbare micro-organismen slechts een klein percentage van de totale microbiota in elke niche uitmaken, moeten verschillende op cultuur gebaseerde en cultuuronafhankelijke technieken tegelijkertijd worden gebruikt om een beter begrip te krijgen van de algehele status van bacteriële diversiteit en de verschillende resistente eigenschappen die in elk monster voorkomen. Een van die robuuste en betrouwbare cultuuronafhankelijke technieken is hele metagenomische DNA-analyse. Deze high-throughput methode is met succes gebruikt in verschillende studies over bacteriële diversiteit of de functionele annotaties van verschillende ARGs 8,9. Deze techniek gebruikt het metagenoom (het totale genetische materiaal in een monster) als uitgangsmateriaal voor verschillende analyses en is dus cultuuronafhankelijk. De protocollen in deze studie kunnen worden gebruikt voor hele metagenomische DNA-analyse om informatie te verkrijgen over de totale bacteriële diversiteit en verschillende ARGs (resistoom) in watermonsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
De monsterverzameling en -verwerking spelen een belangrijke rol en kunnen van invloed zijn op de resultaten en interpretatie van het onderzoek. Om variabiliteit in de monsters uit te sluiten, is het daarom belangrijk om monsters uit te voeren op meerdere locaties van het zoetwaterlichaam dat wordt bestudeerd. Het handhaven van de juiste aseptische omgevingsomstandigheden bij het hanteren van dergelijke monsters kan besmetting voorkomen. Om veranderingen in de bacteriële samenstelling te voorkomen die van invloed kunnen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiële subsidies van het Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme van de Universiteit van Mumbai. Devika Ghadigaonkar werkte als Project Fellow onder de regeling. De technische hulp van Harshali Shinde, Senior Research Fellow onder het Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB) Projectnummer: CRG/2018/003624, wordt erkend.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
