Инженерные клапаны требуют встроенной функциональной сосудистой сети. В этом протоколе мы представляем метод изготовления 3D-печатного тканевого лоскута, содержащего иерархическую сосудистую сеть и ее прямые микрохирургические анастомозы к бедренной артерии крысы.
Инженерия имплантируемых, функциональных, толстых тканей требует проектирования иерархической сосудистой сети. 3D-биопечать – это технология, используемая для создания тканей путем добавления слоя за слоем печатаемых биоматериалов, называемых биочернилами, и клеток упорядоченным и автоматическим образом, что позволяет создавать очень сложные структуры, которые традиционные методы тканевой инженерии не могут достичь. Таким образом, 3D-биопечать является привлекательным подходом in vitro для имитации сложной структуры нативных сосудов, начиная от миллиметровых сосудов и заканчивая микрососудистыми сетями.
Достижения в области 3D-биопечати в гранулированных гидрогелях позволили экструзию с высоким разрешением биочернил на основе внеклеточной матрицы с низкой вязкостью. В этой работе представлен комбинированный подход к 3D-биопечати и жертвенной печати на основе пресс-форм для изготовления инженерных васкуляризированных тканевых лоскутов. 3D-биопечать эндотелиальных и поддерживающих клеток с использованием рекомбинантного коллаген-метакрилатного биочернила в желатиновой поддерживающей ванне используется для изготовления самосборной капиллярной сети. Это печатное микроциркуляторное русло собрано вокруг мезомасштабного сосудоподобного пористого каркаса, изготовлено с использованием жертвенной 3D-печатной формы и засеяно эндотелиальными клетками.
Эта сборка индуцирует эндотелий мезомасштабного сосуда к анастомозу с окружающей капиллярной сетью, создавая иерархическую сосудистую сеть внутри инженерного тканевого лоскута. Затем инженерный лоскут непосредственно имплантируется хирургическим анастомозом в бедренную артерию крысы с использованием техники манжеты. Описанные способы могут быть расширены для изготовления различных васкуляризированных тканевых лоскутов для использования в реконструкционной хирургии и исследованиях васкуляризации.
Тяжелые дефекты тканей вызваны травматическими повреждениями, врожденными дефектами или заболеваниями, и текущий золотой стандарт для лечения этих дефектов заключается в использовании аутологичных трансплантатов, васкуляризированных тканевых лоскутов и микрососудистых свободных лоскутов в качестве заменителей ткани. Однако эти варианты имеют недостатки ограниченной ткани донорского участка и заболеваемости донорского сайта1. Таким образом, растет спрос на альтернативные заменители тканей, которые могут быть использованы для исправления этих дефектов2. Толщина инженерных тканевых конструкций ограничена диффузией питательных веществ и газов к клеткам, и, следовательно, правильная сосудистая сеть необходима для создания больших, толстых и правильно питаемых каркасов.
Для содействия васкуляризации инженерных имплантатов3 было применено несколько подходов, включая рекрутирование in vivo сосудистой поддержки от хозяина, доставку факторов роста и цитокинов в каркасы, преваскуляризацию имплантатов, генерацию перфузируемого ветвящегося микрососудистого слоя с использованием методов микроструктурирования4, использование жертвенных материалов для формирования сосудистых каналов/сетей5 , а также создание каналов в рамках 3D биопечатных конструкций 5,6. Васкуляризация толстых тканей требует включения иерархической сосудистой сети, состоящей из макро- и микрокапиллярных сосудов. Макромасштабные сосуды эффективно распределяют кровь по всей конструкции и позволяют проводить микрохирургические анастомозы с кровеносными сосудами хозяина, в то время как сосуды микрокапиллярного масштаба позволяют диффузию питательных веществ.
Биопечать привлекла большое внимание в последние годы из-за преимуществ, которые она предлагает по сравнению с обычными методами тканевой инженерии. Ткани и органы представляют собой сложные и запутанные 3D-объекты со специфической архитектурой. 3D-биопечать, благодаря своей способности откладывать слои биоматериалов в высоком разрешении, позволяет создавать сложные заменители тканей и органов (например, почки, легкие, печень)7. Для биопечати было адаптировано несколько технологий печати, включая экструзионную струйнуюпечать 8, лазерное осаждение 9,10 и биопечать на основе стереолитографии 11,12. Экструзионные технологии основаны на экструдировании материала через сопло путем применения давления на насыпную поверхность материала, противоположную соплу.
Обратимое встраивание взвешенных гидрогелей свободной формы (FRESH) представляет собой метод биопечати13,14, в котором используется гранулированный опорный материал, в котором экструдированный материал осаждается и фиксируется на месте опорной ванной. Опорная ванна обеспечивает механическую поддержку экструдированного, предварительно сшитого биочернила до его сшивания. Основным преимуществом данной методики является то, что опорная ванна позволяет экструдировать низковязкие материалы, которые не могут сохранять свою форму после экструзии и перед сшиванием15. Это расширяет пул доступных материалов, которые могут быть использованы в качестве биочернил.
В этой статье представлен протокол генерации васкуляризированного лоскута, который сочетает в себе микромасштабные и мезомасштабные сосудистые сосуды. Для достижения этой цели биопечатные, самособирающиеся микрососудистые сети генерируются в рекомбинантном гидрогеле метакрилата коллагена человека (rhCollMA), который затем соединяется с внутренней частью более крупного, имплантируемого сосудистого каркаса, в результате чего образуется полностью спроектированный тканевый лоскут16. Для установления быстрой и прямой перфузии инженерных тканей требуется прямой микрохирургический анастомоз сосудов хозяина. Сосудистый каркас не имеет достаточной прочности удержания шва для анастомозирования с использованием традиционного микрохирургического шва стенки сосуда. Поэтому мы описываем метод «манжеты» 17,18,19 для достижения анастомоза общей бедренной артерией крысы. При этом способе концы сосуда закрепляются кольцевыми швами, без необходимости перфорации стенки сосуда.
Хотя предлагаемый протокол был подготовлен для изучения иерархической сосудистой системы в среде rhCollMA, этот подход может быть расширен и применен к различным новым приложениям. Протокол может быть применен для биопечати различных тканеспецифических клеток в разных биочернилах. Кроме того, геометрия и размер конструкций могут быть легко изменены в соответствии с конкретными требованиями, такими как реконструкция больших тканей или биологические исследования.
Инженерия васкуляризированных тканей является одной из основных задач тканевой инженерии20. Современные методы создания инженерной сосудистой ткани сосредоточены на создании самособранного микроциркуляторного русла 21,22,23 или изготовлении мезомасштабных сосудистых каркасов24,25, а не на воссоздании системы иерархической сосудистой системы, которая может быть перфузирована сразу и непосредственно после имплантации26 . В этой работе мы описываем протокол, который использует две модальности 3D-печати для создания иерархической сети сосудов, состоящей из микромасштабных и мезомасштабных сосудов. Протокол сочетает в себе 3D-биопечатную, самособранную микрососудистую сеть с мезомасштабным сосудистым каркасом, достигая имплантируемого, васкуляризированного лоскута. Кроме того, в этой статье представлен протокол для непосредственного анастомозирования этого лоскута в бедренную артерию крысы.
3D-биопечать приобрела интерес в последние годы из-за ее универсальности по сравнению с традиционными методами тканевой инженерии. Хотя этот протокол описывает генерацию микрососудистой сети в биочерниле rhCollMA, используемые методы могут быть применены с небольшими изменениями ко многим другим биочерням из множества изученных и новых биочернил и поддерживающих ванн27,28. Мы решили использовать rhCollMA в качестве биочернила из-за обилия коллагена типа I в ECM человека, обеспечивая подходящую среду для прикрепления клеток. Кроме того, он производится рекомбинантно в растениях и дополнительно модифицируется метакрилатными группами, что позволяет проводить фотополимеризацию и образование стабильных 3D гидрогелей29,30. Фотокроссылка была достигнута путем добавления фотоинициатора LAP, который, как было показано, не токсичен и активируется воздействием синего света 405 нм, уменьшая возможную фототоксичность ультрафиолетового света. Однако использование светочувствительных биочернил требует использования фенольной питательной среды без красного цвета для приготовления биочернила и поддерживающего материала. Кроме того, протокол описывает использование желатинового опорного материала, который обеспечивает высокоточную экструзию биочернил, таких как rhCollMA. Таким образом, крайне важно обеспечить использование холодной среды во время ее приготовления и охлаждения принтера. Чрезмерный нагрев может произойти из-за источника света, используемого для сшивания, или от повышенных температур окружающей среды.
Биопринтер на основе экструзии был использован здесь для создания биопечатной микрососудистой сети, и в настоящее время существует много коммерчески доступных биопринтеров, которые могут генерировать подобные конструкции. Кроме того, предложенные методы могут быть легко модифицированы и применены для изучения различных геометрий, размеров и закономерностей заполнения. В этой работе был выбран прямолинейный рисунок заполнения для создания взаимосвязанных пор, и его можно напечатать относительно быстро с высокой точностью.
Пузырьки воздуха создают значительную проблему в экструзионной биопечати, особенно внутри вспомогательных материалов. Поэтому крайне важно свести к минимуму наличие и образование этих пузырьков за счет использования пипеток с положительным смещением для переноса опорного материала, приготовления биочернило-клеточной суспензии и переноса их на картриджи.
В этой работе эндотелиальные клетки, полученные из жировой ткани человека, и стволовые клетки пульпы зубов использовались в качестве поддерживающих клеток из-за их относительно легкой изоляции от пациентов. Кроме того, была выбрана общая концентрация клеток 8 х 106 клеток/мл, поскольку было показано, что эта концентрация создает наиболее развитые сосудистые сети16. Хотя этот протокол может быть использован для создания микроциркуляторного русла с использованием различных типов клеток и источников, а также различных биочернил, калибровка концентрации клеток должна быть выполнена для установления наилучших условий для развития микрососудистой сети. Кроме того, тканеспецифические клетки (т.е. миобласты или остеобласты) могут быть включены в биочернило для достижения тканеспецифических васкуляризированных лоскутов.
Форма для пористого сосудистого каркаса была изготовлена с использованием 3D-печатного водорастворимого материала на коммерчески доступном экструзионном 3D-принтере. Это приводит к экономически эффективному методу, основанному на платформах быстрого прототипирования, так что многие различные геометрии и размеры сосудистых каркасов могут быть изучены и быстро проверены31. Тем не менее, ограничением этого метода является предел разрешения большинства 3D-принтеров32. Однако с быстро развивающейся отраслью, связанной с аддитивным производством, эти ограничения, как ожидается, со временем улучшатся. Использование органических растворителей для процесса изготовления является еще одним ограничением протокола, так как большинство органических растворителей токсичны для клеток, предотвращая возможность сочетания процедуры биопечати с процессом изготовления сосудистого каркаса.
Описанный способ посева просвета каркаса с использованием аспирации в отличие от выталкивания клеточной суспензии оказывает значительное влияние на локализацию засеянных клеток. Использование отрицательного давления позволяет проводить эндотелизацию внутреннего просвета каркаса при минимизации любого разлива клеточной суспензии через перфорации на стенкекаркаса 16.
Описанный «манжетный» способ для микрохирургических анастомозов может быть легко модифицирован и адаптирован к различным материалам или размерам сосудистых каркасов, а также к различным артериям и венам в широком масштабе животных моделей. Адаптация к протоколу будет включать в себя различные размеры полиимидных трубок и размеры швов. Этот метод не требует перфорации стенки каркаса, что может привести к развитию дефектов. Эта работа представляет собой протокол, который может быть расширен на многие приложения. Критические аспекты этого протокола, которые включают изготовление мезо- и микромасштабных сосудов и их сборку и имплантацию, представляют собой критические аспекты инженерных лоскутов как для реконструктивных применений, так и для сосудистых и других тканевых инженерных исследований.
The authors have nothing to disclose.
Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках Программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 818808). rhCollMA была щедро предоставлена CollPlant (Реховот, Израиль). Авторы благодарят Управление доклинических исследований Техниона за помощь в уходе за животными, а также Джанетт Завин, Галию Бен Давид и Идана Реденски.
1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
Acland clamps | S&T | B-1V | |
Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
Duratears | Alcon | DJ03 | |
ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | – | |
Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
NEAA | Gibco | 11140068 | |
Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
Scalpel handle – #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |