3D Baskı Teknolojileri Kullanılarak Mühendislik Vasküler Flaplarının İmalatı

Tüm hayvan prosedürleri, Technion Klinik Öncesi Araştırma Otoritesi’nin (PCRA Technion, etik onay no. 058-05-20) gözetiminde onaylanmış ve yürütülmüştür. Bu çalışmalar için erkek Sprague-Dawley sıçanları (275-350 g) kullanılmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu’na bakın. 1. Vasküler iskele imalatı Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak istenen vasküler iskele şeklinin 3D bilgisayar modelini oluşturun veya çevrimiçi depolardan istenen vasküler yapının 3D dosyasını indirin. İç çapı 0,9 mm, dış çapı 2 mm ve yüksekliği 18 mm olan bir silindir oluşturun. Silindir duvarının yanına 0,22 mm çapında radyal fenestrasyonlar ekleyin. 3D tasarım yazılımını kullanarak iskele için bir kalıp oluşturun ve . STL dosyası. Ardından, daha sonra kalıbın doldurulmasını kolaylaştırmak için tasarıma bir huni ekleyin. . STL dosyası, kaynaşmış biriktirme modelleme (FDM) 3D yazıcı için dilimleme yazılımına dönüşür. Modeli 0,1 mm katman yüksekliğinde dilimleyin ve .gcode olarak dışa aktarın veya doğrudan 3B yazıcıya gönderin. 3D, kalıbı, suda çözünür büten-diol vinil alkol kopolimeri (BVOH) filamenti kullanarak 0,25 mm’lik bir nozulla donatılmış bir FDM 3D yazıcıya yazdırın. Basılı kalıpları kullanıma kadar bir vakum odasında saklayın.DİKKAT: BVOH filamentini neme duyarlı olduğu için çıplak elle kullanmaktan kaçının. Ek olarak, neme maruz kalmayı önlemek için filamentin bir vakum odasında saklanması önerilir. 1,4-dioksan’da 1: 1 poli-L-laktik-asit (PLLA) ve polilaktik-ko-glikolik-asit (PLGA) karışımından oluşan bir polimer çözeltisi hazırlayın. 350 mg PLLA ve 350 mg PLGA tartın ve 20 mL’lik bir cam şişeye aktarın. 10 mL 1,4-dioksan ölçün ve bir cam pipet kullanarak cam şişeye aktarın. Cam şişeye küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin.DİKKAT: 1,4-Dioksan tehlikeli bir organik çözücüdür. Uygun kişisel güvenlik ekipmanlarını kullanın ve bir duman davlumbazının içinde çalışın. Cam şişeyi 70 ° C’ye ısıtılmış bir sıcak su banyosuna yerleştirin ve tüm polimerler tamamen çözünene kadar içeriği gece boyunca karıştırın. Çözeltiyi kullanana kadar hava geçirmez bir cam kapta saklayın. BVOH kalıplarını PLLA:PLGA çözümü ile doldurun. Pozitif deplasmanlı pipet kullanarak, polimer çözeltisinin 30 μL’sini ölçün ve kalıbı doldurun.NOT: Kalıbı doldurmak için gereken hacim, tasarlanan kabın hacmine göre değişecektir. Kalıbın hunisi tamamen dolana kadar polimer çözeltisini eklemeye devam edin. Kalıbı 2 dakika boyunca 100 × g’da santrifüj yapın. Tam doldurmayı sağlamak için kalıbı 20 μL polimer çözeltisi ile doldurun. Tüm polimer çözeltisinin donmasını sağlamak için doldurulmuş kalıpları -80 ° C’de en az 30 dakika dondurun. Çözücüyü gece boyunca liyofilize ederek kalıplardan çıkarın.NOT: Dondurarak kurutma işleminden sonra kalıptaki polimerin rengi berraktan beyaza dönmelidir. Kurban kalıp malzemesini çıkarmak için, dondurarak kurutma işleminden sonra kalıpları hafifçe karıştırarak 5 L’lik deiyonize su banyosuna aktarın. Bulutlu olduğunda banyodaki suyu değiştirin. Tüm BVOH çözündüğünde, iskeleleri havayla kurutun ve kullanıma kadar bir vakum odasında saklayın. 2. Vasküler iskelenin fibronektin ile kaplanması PLLA: PLGA vasküler iskeleleri 30 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak dezenfekte edin. İskeleleri PBS ile 3x 5 dakika yıkayın. PBS’de 50 μg / mL insan fibronektininin seyreltilmesini hazırlayın ve iskeleleri kaplayın. 500 μL stok fibronektin çözeltisini (1 mg / mL) 9.5 mL PBS ile karıştırın. Dezenfekte edilmiş vasküler iskeleleri bu fibronektin çözeltisine batırın ve protein adsorpsiyonuna izin vermek için 60 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bağlanmamış fibronektini çıkarmak için iskeleleri PBS ile durulayın. Bu kaplamalı iskeleleri 4 °C’de 1 haftaya kadar saklayın. 3. rhCollMA biyomürekkep hazırlama Asidik rhCollMA biyomürekkep stoğunu nötralize etmek için bir fosfat tamponu hazırlayın. 50 mL deiyonize suda 5.495 g Na 2 HPO 4, 1.55 gNaH2PO4 ve 30 mg NaCl çözerek 10x fosfat tamponu stoğu hazırlayın. 10x fosfat tamponunun 1 parçasını 9 parça deiyonize su ile birleştirerek 10x stok fosfat tamponunun 10 kat seyreltilmesini hazırlayın. Asidik rhCollMA çözeltisini nötralize etmek için 900 μL stok rhCollMA çözeltisini 100 μL 10x fosfat tamponu ile birleştirin. Nötralize edilmiş rhCollMA çözeltisini, gerekli miktarda 1x fosfat tamponu ile karıştırarak istenen 10 mg / mL konsantrasyonuna seyreltin.NOT: rhCollMA’nın stok konsantrasyonu lotlar arasında değişir. Bu nedenle, istenen konsantrasyona ulaşmak için gereken 1x fosfat tamponunun hacmi değişecektir. Porojen-fotobaşlatıcı çözeltisini (PEO-LAP) seyreltilmiş nötr rhCollMA ile birleştirilecek şekilde hazırlayın. 10 mL DMEM’de 160 mg PEO’yu çözerek fenol kırmızısı içermeyen DMEM’de% 1.6’lık bir poli(etilen oksit) (PEO) çözeltisi hazırlayın. Çözeltide% 0.2 (w / v) LAP elde etmek için bu çözeltiye 20 mg lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfin (LAP) ekleyin. Bu noktadan itibaren, çözeltiyi alüminyum folyo ile örtün veya ışıktan korumak için karanlık bir yerde saklayın. PEO-LAP çözeltisini 0,22 μm’lik bir filtreden geçirerek sterilize edin. Bu çözeltiyi 4 ° C’de 1 haftaya kadar saklayın. Biyobaskıdan önce, nihai biyomürekkep çözeltisini elde etmek için seyreltilmiş nötr rhCollMA çözeltisini PEO-LAP çözeltisi ile 1: 1 oranında karıştırın. Hava kabarcıklarından kaçınırken çözeltileri karıştırmak için bir girdap yerine pipetleme kullanın. Çözeltiye çok fazla kabarcık girerse, 30 s boyunca 2.000 × g’de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, homojenliği sağlamak için biyomürekkep çözeltisini tekrar karıştırın. 4. Granüler destek banyosu hazırlığı Jelatin granüler destek malzemesi hazırlayın. Biyolojik bir güvenlik kabininde, bir 2 g’lık liyofilize destek malzemesi tüpünün içeriğini, her biri yaklaşık 1 g içeren iki steril 50 mL konik tüpe bölün. Her tüpe 40 mL soğuk (4 °C) fenol-kırmızı içermeyen DMEM ekleyin ve tüm liyofilize destek malzemesi çözülene kadar kuvvetli bir şekilde vorteks yapın. Destek malzemesinin yeniden hidrasyonuna izin vermek için elde edilen bulamacın 4 ° C’de oturmasına izin verin. Kabarcıkları azaltmak için destek malzemesini bir vakum odasında 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Destek malzemesini 5 dakika boyunca 2.000 × g’da santrifüj yapın. Malzemenin tüpün dibinde olduğundan ve süpernatantın net olduğundan emin olun. Alttaki destek malzemesini aspire etmemeye dikkat ederken, süpernatanı aspire edin.NOT: Destek malzemesi, süpernatan çıkarıldıktan sonra tüpü eğimli hale getirirken akmamalıdır. Malzeme akarsa, aynı ayarları kullanarak ancak yeni süpernatant eklemeden tekrar santrifüj yapın. Hazırlanmış, sıkıştırılmış destek malzemesinin yaklaşık 4 mL’sini, pozitif deplasmanlı bir pipet kullanarak 12 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Destek malzemesini kuyuya eşit şekilde yayılmaya zorlamak için kuyu plakasına sert bir yüzeye dokunun.NOT: Önerilen minimum destek malzemesi hacmi, içine yazdırılacak yapının hacminin 3 katıdır. Kuyu plakasını, jelatin parçacıklarının erimesini önlemek için kullanılıncaya kadar soğutulmuş bir biyoyazıcı aşamasına veya 4 ° C’ye destek malzemesiyle birlikte yerleştirin. 5. Endotel hücrelerinin ve destek hücrelerinin biyomürekkeple birleştirilmesi Bazal ortamı, bir antibiyotik çözeltisi, fetal sığır serumu ve endotel hücresi büyüme takviyeleri dahil olmak üzere karşılık gelen orta kit bileşeniyle karıştırarak üreticinin talimatlarına göre endotel hücre ortamı hazırlayın. 500 mL düşük glukozlu DMEM, 58 mL fetal sığır serumu, 5.8 mL esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 5.8 mL glutamin ikamesi, 5.8 mL 1 M HEPES ve 5.8 mL penisilin-streptomisin-nistatin çözeltisini birleştirerek diş pulpası kök hücre ortamı hazırlayın. 10 mL endotel hücre ortamında 2 × 10 6 ZsGreen1 eksprese eden insan yağ mikrovasküler endotel hücreleri (HAMEC-ZsGreen1) ve 6 × 106 diş pulpası kök hücresi (DPSC) içeren bir süspansiyon hazırlayın. Bir hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu 200 × g’da 4 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatant ortamı aspire edin. Hücre peletini daha önce hazırlanan 1 mL rhCollMA biyomürekkebinde (PEO-LAP içeren) yeniden askıya alarak, 1 mL biyomürekkep başına toplam hücre konsantrasyonu 8 × 106 hücreye sahip bir biyomürekkep elde edin.DİKKAT: Biyomürekkebi hücrelerle birleştirdikten sonra, hemen bir sonraki adıma geçin. Hücreler süspansiyonda uzun süre bırakılırsa, hücreler tüpün dibine batar ve canlılıkları bozulur. Hücreleri içermeyen deneyler için, Adım 5.1-5.5’i atlayın veya basılı yapıların gelişmiş mikroskobik görselleştirmesi için hücreler yerine biyomürekkeple floresan boncukları dahil edin. Hücreler-biyomürekkep karışımını baskı kartuşlarına aktarın. 3 mL amber yazıcı kartuşuna 0,22 mm dahili çaplı bir iğne takın ve kartuşu 50 mL’lik konik bir tüpe yerleştirin. Kabarcıkları azaltmak için pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak 1 mL hücre-biyomürekkep karışımını üstten doldurarak yazıcı kartuşuna aktarın. Yazıcı kartuşunu biyoyazıcıdaki uygun araca takın. 6. rhCollMA biyomürekkep kullanarak mikrovasküler ağların biyobaskısı Biyobaskılı mikrovasküler ağ için bir 3B CAD tasarımı oluşturun. Merkezinde 2 mm çapında dairesel bir kanal içeren 4 mm’lik bir karenin 2B desenini çizin. Merkezi kanallı 4 mm x 4 mm x 4 mm küp elde etmek için çizimi 4 mm ekstrüzyon yapın. Bu nesneyi . STL dosyası. 12 kuyulu bir plaka ithal edin. STL şablonu, biyoyazıcı dilimleme yazılımındaki katı modelleme sekmesine yerleştirin ve sanal baskı yatağının belirlenen alanına yerleştirin. . Küp şeklinin STL dosyası, biyoyazıcı dilimleme yazılımındaki katı modelleme sekmesine yerleştirilir. Harici dilimleyici kullan onay kutusuna tıklayın | nesne özellikleri bölümünün altında dilimleyiciyi yapılandırın. Açılır pencerede, dolgu deseni için doğrusal bir desen seçin ve dolgu yoğunluğuna yazın. Kabul et’i tıklayın. Küp şeklinin bir kopyasını, küpe tıklayarak ve fareyi kullanarak hareket ettirerek istediğiniz her sanal kuyucuğa yerleştirin. Malzeme ekle düğmesini tıklatarak biyoyazıcı dilimleme yazılımının malzemeler sekmesinde rhCollMA bioink için yeni malzeme ayarları oluşturun. Yazdırma için malzemenin ayarlarını seçin. Basınç için, ilgili kutuya 2 psi yazın. Hız için, ilgili kutuya 20 mm/s yazın.NOT: Her biyomürekkep malzemesinin, uygulamadaki malzeme listesine kaydedilebilen kendi farklı yazdırma ayarları vardır. Çizgi genişliği ve çizgi yüksekliği değerlerini 0,24 mm’ye ve ivme değerini 400 mm/s2’ye atayın, bu değerleri ilgili kutulara yazın. Katı modelleme sekmesinde, küp nesnesine tıklayın ve ardından küp şekline atamak için malzemeler bölümünden rhCollMA malzemesine tıklayın. Biyomontaj sekmesinde, yazdırma işini biyoyazıcıya göndermek için yazdırma işini gönder düğmesine tıklayın. Hücresel biyomürekkeple yüklü baskı kartuşunu, 3D ekstrüzyon tabanlı biyoyazıcının 3 mL ortam pnömatik dağıtım aracına yükleyin. Bioprinter arabirim ekranındaki Kontrol-Isıtma/Soğutma sekmesinin altındaki soğutma düğmesine tıklayarak baskı yatağı sıcaklığını 4 °C’ye ayarlayın. Plakayı yazıcı yatağındaki destek banyosuyla yükleyin.NOT: Malzemenin baskı basıncı ve hızı ayarları, ortam sıcaklığındaki farklılıklar veya biyomürekkep toplu iş değişkenliği nedeniyle değişebilir. Örneğin, soğuk günlerde, aynı miktarda malzemeyi ekstrüzyon yapmak için daha yüksek bir basınç veya daha yavaş bir hız gerekir. Biyoyazıcı arabirimi ekranındaki yazdır sekmesinde, Adım 6.7’de gönderilen yazdırma işini tıklatın. tıklayın ve yazdırma işine başlamak için başlat | gidin’i tıklatın. Baskıdan sonra, rhCollMA biyomürekkebinin çapraz bağlanmasını başlatmak için kuyu plakasını 30 s boyunca 3 mW /cm2 yoğunluğa sahip 405 nm ışık kaynağına maruz bırakın. Çapraz bağlamadan sonra, kuyu plakasını 37 ° C’de ve% 5 CO2’de , tüm destek banyosu eriyene kadar en az 20 dakika boyunca inkübe edin. Sıvılaştırılmış destek banyosunu nazikçe aspire edin ve endotel hücre ortamı ile değiştirin. Sonraki adımlarda kullanana kadar yapıları 37 °C ve %5 CO2’de inkübe edin.NOT: Baskıyı takiben yapının büzülmesi nedeniyle, montaj Adım 7’nin Adım 6 ile aynı gün yapılması önerilir. 7. Mühendislik vaskülarize flebi elde etmek için biyobaskılı mikrovasküler ağın vasküler iskele ile birleştirilmesi Biyobaskılı mikrovasküler ağın destek malzemesinin çıkarılmasından hemen sonra, biyobaskılı yapının ana kanalına fibronektin kaplı bir PLLA: PLGA vasküler iskele yerleştirin. Montajlı yapıları 2 gün boyunca 37 ° C’de ve% 5 CO2’de inkübe edin. Vasküler iskelenin lümenini endotel hücreleri ile hizalayın. TdDomates eksprese eden insan yağ mikrovasküler endotel hücrelerinin (HAMEC-tdDomates) hücre süspansiyonunu 1 × 107 hücre / mL konsantrasyonunda hazırlayın. Bu hücre süspansiyonunun 20 μL’lik bir damlacığını hidrofobik bir yüzeye (yani, doku dışı bir kültür [TC olmayan] 10 cm’lik bir kab) yerleştirin. Vasküler iskeleleri damlacığın üzerine yavaşça yerleştirin, böylece bir ucundaki iskelenin lümeni hücre damlacığı ile temas eder. Damlacığı iskelenin karşı ucundan (yani, damlacıkla temas etmeyen uçtan) aspire edin, lümenini hücre süspansiyonu ile doldurun. Tohumlanmış iskeleyi bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörün içindeki bir rotatöre koyun. Daha sonra, iskeleyi 12 delikli bir plakaya aktarın ve 2 mL endotel hücre ortamı ekleyin. Kültür, mühendislik fleplerini 7 gün boyunca şekillendirirken, her 2 günde bir besiyeri taze endotel hücre ortamı ile değiştirir. 8. Konfokal mikroskopi ve mühendislik fleplerinin immünofloresan boyanması 4 gün ve 7 günlük kültürden sonra, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak monte edilmiş iskelelerin canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirin. Mikroskop görüntü yakalama yazılımında ZsGreen1 ve tdDomates floresan proteinleri için floresan kanallarını tanımlayın. 0,5x yakınlaştırmalı (piksel boyutu 5 μm) 5x/0,16 objektif bir lens seçin ve her biri 41 μm kalınlığa sahip 22 dilimli bir Z-yığını tanımlayın. Tüm yapıyı görüntülemek ve yakalamak için 3 x 2 karo taraması tanımlayın. Doygunluk olmadan ve minimum arka plan olmadan net bir floresan sinyali elde etmek ve görüntüleri elde etmek için lazer yoğunluğunu ayarlayın ve değerler kazanın. Mikroskop görüntü alma yazılımını veya benzer görüntü analiz yazılımını kullanarak tek bir 2D görüntü elde etmek için edinilen Z-yığınının maksimum yoğunlukta bir projeksiyonunu gerçekleştirin. İlgilenilen bir bölgenin daha yüksek büyütmeli görüntülemesini gerçekleştirin. 0,5 yakınlaştırmalı (piksel boyutu 1,25 μm) 10x/0,3 objektif lense geçin ve 9 dilim kalınlığında 41 μm kalınlığında bir Z-yığını tanımlayın. 8.2.-8.3 Adımlarını gerçekleştirin. 7 günlük kültürden sonra, mühendislik kapaklarını 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içine batırarak sabitleyin. Yapıları PBS ile 3x 5 dakika yıkayın. PBS’de% 0.3 (v / v) Triton-X’i yapılara ekleyin ve hücreleri geçirgenleştirmek için oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Yapıları PBS ile 3x 5 dakika yıkayın. PBS’de% 5 (w / v) sığır serum albümini (BSA) çözerek bir blokaj çözeltisi hazırlayın. Blokaj solüsyonunu mühendislik kapaklarına ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. SMA eksprese eden destek hücrelerini boyamak için daha önce hazırlanan% 5 BSA çözeltisinde fare anti-düz kas aktinini (anti-SMA) 1:50 antikoru seyrelterek birincil antikor çözeltisini hazırlayın. İskeleleri birincil antikor çözeltisinde gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. PBS ile 3x 5 dakika yıkayın. PBS’de Cy3-konjuge keçi anti-fare IgG 1:400 antikoru ve 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 2.5 μg / mL) seyrelterek ikincil antikor çözeltisini hazırlayın. İkincil antikor çözeltisini iskelelere uygulayın ve oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin. PBS ile 3x 5 dakika yıkayın. Yapıları PBS’de 4 °C’de 1 aya kadar saklayın. Lekeli iskeleleri konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Mikroskop görüntü yakalama yazılımında üç floresan kanalı (DAPI, ZsGreen ve Cy3) tanımlayın. Toplam kalınlığı 50 μm’ye yayılan 2 μm kesit kalınlığına sahip bir Z-yığını tanımlayın. Ardından, yapının daha büyük alanlarını görüntülemek için bir döşeme taraması tanımlayın. Doygunluk olmadan ve minimum arka plan olmadan net bir floresan sinyali elde etmek için alma parametrelerini ayarlayın. 1,0x yakınlaştırma (piksel boyutu 0,31 μm) ile 20x/0,8 hedef kullanarak görüntüleri elde edin. Mikroskop görüntü alma yazılımını veya benzer görüntü analiz yazılımını kullanarak tek bir 2D görüntü elde etmek için edinilen Z-yığınının maksimum yoğunlukta bir projeksiyonunu gerçekleştirin. 9. Bir manşet tekniği kullanarak mühendislik flebinin doğrudan bir sıçanın femoral arterine anastomoz edilmesi Aşağıdaki cerrahi aletleri hazırlayın ve sterilize edin (otoklav): No. 15 neşter, bir çift ince dişli forseps ve küçük bir çift halka saplı makas. Ek olarak, aşağıdaki mikrocerrahi aletleri hazırlayın ve sterilize edin: düz ince sivri uçlu No. 3 kuyumcu forsepsleri, açılı bir kuyumcu forsepsleri, kavisli çeneli yuvarlak saplı bir iğne tutucu, bir çift damar dilatörü, disseksiyon makasları, adventitia makasları ve aplikatörleriyle damar kelepçeleri. 5 mL stok heparin çözeltisini 195 mL salin ile seyrelterek 100 IU / mL heparinize salin çözeltisi hazırlayın. Poliimid manşetleri kesin ve sterilize edin. Diseksiyon mikroskobu altında bir poliimid tüpün 2,5 mm’lik bölümlerini kesin. Her bölümün bir ucunda, bir manşet sapı elde etmek için tüpün duvarında 1.25 mm’lik uzunlamasına bir kesi yapın. Damar sapmasını kolaylaştırmak için tüpün diğer ucunda açılı bir kesim yapın. Manşetleri% 70 etanol içine batırın, ardından heparinize salin ile iki yıkama yapın. Ameliyat için bir erkek Sprague-Dawley sıçanı (275-350 g) hazırlayın. Ameliyattan yedi gün önce, bağışıklık baskılanmasını sağlamak için deri altı günlük siklosporin dozu (10 mg kg-1) uygulamaya başlayın. Ameliyattan önce, bir indüksiyon odası kullanarak kurumsal SÇP’ye göre %3 izofluran inhalasyonu kullanarak hayvanı uyuşturun. Her iki ayağı da sıkıştırarak ve refleksleri kontrol ederek derin anesteziyi doğrulayın. Subkutan dozda analjezik buprenorfin (0.03 mg kg-1) ve antikoagülatif heparin (200 IU kg-1) uygulayın. Dehidrasyonu önlemek için hayvanın gözlerine yağlayıcı bir göz merhemi uygulayın. Sıçanın cerrahi bölgesini tıraş edin ve bölgeyi iyot ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. Yapışkan bant kullanarak hayvanın uzuvlarını masaya sabitleyin. Ortak femoral arteri açığa çıkarın ve izole edin. Bacak ve karın arasındaki konkavite boyunca deriden 2 cm uzunluğunda, eğik bir kesi yapın. Forseps ve künt uçlu makas kullanarak, kasık yağ yastığını görselleştirmek için cildi altta yatan dokudan serbest bırakın. Makas ve forseps kullanarak, üst, medial ve alt kenar boşluklarının etrafındaki yağ yastığını kesin. Yağ yastığının altındaki büyük damarları kesmemeye dikkat edin. Yağ yastığını yanal olarak yansıtın ve epigastrik damarları sağlam bırakın. Kurumasını önlemek için yansıyan yağ yastığına ıslak bir gazlı bez yerleştirin ve yerine sabitleyin. Ortak femoral damarların görünür olduğundan emin olun.NOT: Yağ yastığı daha sonra anastomozlara yumuşak basınç uygulamak için kullanılacaktır. Femoral arteri inguinal ligamentten epigastrik arter dallanma noktasına distal olarak kılıfından çıkararak maruz bırakın.DİKKAT: Genellikle altında çalışan femoral arterin bir dalı vardır, genellikle Murphy dalı olarak adlandırılır. Bu görülmesi zor dala zarar vermemeye dikkat edin. Murphy’nin dalını bağlayarak bölün ve ardından femoral arteri, arterin ortasındaki 1 mm aralıklı iki ligatür ile bağlayın. Ligatür süderinin bir ucunu, damar ucunu manşetten çekmek için daha sonra kullanmak üzere uzun tutun. Adventitia makası kullanarak iki ligatür arasındaki arteri kesin.DİKKAT: Bu kesimi yaparken kanama olmamalıdır. Arteriyel uç kanarsa, arteri kelepçeleyin ve bir ligatürü tekrar uygulayın. Ligatür süderinin uzun ucunu kullanarak, her bir damar ucunu önceki adımda hazırlandığı gibi bir poliimid manşete yerleştirin, böylece iki manşetin tutamaçları birbirinden uzağa bakacak şekilde yerleştirilir. Yerleştirdikten sonra, manşet sapına ve kaba aynı anda bir kelepçe uygulayın ve manşeti yerine sabitleyin. 27 G iğne ile donatılmış bir şırıngada heparinize bir salin çözeltisi hazırlayın. Bağlı damar ucunu çekin ve ligatüre yakın kesin. Hemen damar ucunu heparinize salin ile lümende kan görünmeyene kadar iyice yıkayın.DİKKAT: Damar ucunun iyice yıkandığından emin olun, çünkü içeride kalan herhangi bir kan, prosedürü tamamladıktan sonra kan dolaşımına sokulacak bir pıhtı oluşturacaktır. Bu, damarın tıkanmasına ve bacağa perfüzyon kaybına neden olabilir. Geminin lümenini bir elinizle kılıfından tutarak ve diğer elinizle damar dilatörüyle lümenini genişleterek genişletin. Manşet gövdesinin etrafına gevşek bir 6-0 polipropilen çevresel dikiş yerleştirin. Damar, manşet gövdesi üzerinde iki damar dilatörü kullanarak sona erer ve çevresel sütürü sıkarak yerine sabitler.NOT: Manipülasyonlar sırasında kelepçelenmiş damardan herhangi bir kan sızarsa, lümeni heparinize salin ile iyice yıkayın. Mühendislik kapağını heparinize salin ile durulayın ve ardından damar kaplı manşeti vasküler iskelenin lümenine yerleştirin. İskele ve manşet gövdesinin etrafına çevresel 6-0 polipropilen dikiş yerleştirerek iskeleyi yerine sabitleyin. Bu adımı vasküler iskelenin her iki tarafı için yapın. Mühendislik kapağını çevreleyen dokudan izole etmek için anastomoz bölgesinin etrafına 0,2 μm’lik bir polistiren membran filtresi sarın. Önce distal kelepçeyi serbest bırakın; Daha sonra, damardaki kan akışını yeniden sağlamak için proksimal kelepçeyi serbest bırakın. Anastomozlardan herhangi bir kanamayı durdurmak için, yağ yastığını femur damarlarının üzerine geri yansıtın ve 3 dakika boyunca steril bir gazlı bez kullanarak hafif bir basınç uygulayın. Yağ yastığını 6-0 polipropilen kullanarak tekrar yerine dikiştirin; Daha sonra 5-0 PGA emilebilir dikiş kullanarak cildi dikin. Yara bölgesini salin ile temizleyin ve iyot çözeltisi uygulayın. Postoperatif ağrı ve hayvan yönetimi için, içme suyunda% 0.1 (v / v) tramadol hazırlayın. Ayrıca, günlük bir heparin (200 IU kg-1) ve siklosporin (10 mg kg-1) dozu uygulayın. Hayvanı bir ısıtma lambasının altına yerleştirilmiş temiz bir kafese yerleştirin. Sternal yatışlığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı izlemeye devam edin.