Fabricación de colgajos vasculares de ingeniería utilizando tecnologías de impresión 3D

Todos los procedimientos en animales fueron aprobados y realizados bajo la supervisión de la Autoridad de Investigación Preclínica de Technion (PCRA Technion, aprobación ética no. 058-05-20). Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (275-350 g) para estos estudios. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo. 1. Fabricación de andamios vasculares Cree un modelo informático 3D de la forma de andamio vascular deseada utilizando el software de diseño asistido por ordenador (CAD) o descargue un archivo 3D de una estructura vascular deseada de repositorios en línea. Cree un cilindro con un diámetro interior de 0,9 mm, un diámetro exterior de 2 mm y una altura de 18 mm. Agregue fenestraciones radiales con un diámetro de 0,22 mm junto a la pared del cilindro. Cree un molde para el andamio utilizando el software de diseño 3D y expórtelo como un archivo . Archivo STL. A continuación, agregue un embudo al diseño para facilitar el llenado del molde más adelante. Importe el archivo . STL en el software de corte para la impresora 3D de modelado por deposición fundida (FDM). Corte el modelo con una altura de capa de 0,1 mm y expórtelo como .gcode o envíelo directamente a la impresora 3D. Imprima el molde en 3D en una impresora 3D FDM equipada con una boquilla de 0,25 mm, utilizando filamento de copolímero de alcohol vinílico buteno-diol (BVOH) soluble en agua. Guarde los moldes impresos en una cámara de vacío hasta su uso.PRECAUCIÓN: Evite manipular el filamento BVOH con las manos desnudas, ya que es sensible a la humedad. Además, se recomienda almacenar el filamento en una cámara de vacío para evitar la exposición a la humedad. Preparar una solución polimérica de una mezcla 1:1 de ácido poli-L-láctico (PLLA) y ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) en 1,4-dioxano. Pesar 350 mg de PLLA y 350 mg de PLGA y transferir a un vial de vidrio de 20 ml. Mida 10 ml de 1,4-dioxano y transfiéralo al vial de vidrio con una pipeta de vidrio. Agregue una pequeña barra de agitación magnética al vial de vidrio.PRECAUCIÓN: El 1,4-dioxano es un disolvente orgánico peligroso. Use el equipo de seguridad personal adecuado y trabaje dentro de una campana extractora de humos. Coloque el vial de vidrio dentro de un baño de agua caliente calentado a 70 ° C y mezcle el contenido durante la noche hasta que todos los polímeros se disuelvan por completo. Guarde la solución en un recipiente de vidrio hermético hasta su uso. Llene los moldes BVOH con la solución PLLA:PLGA. Usando una pipeta de desplazamiento positivo, mida 30 μL de la solución de polímero y llene el molde.NOTA: El volumen necesario para llenar el molde cambiará de acuerdo con el volumen del recipiente diseñado. Siga agregando la solución de polímero hasta que el embudo del molde esté completamente lleno. Centrifugar el molde a 100 × g durante 2 min. Rellene el molde con otros 20 μL de la solución de polímero para garantizar un llenado completo. Congele los moldes llenos a -80 °C durante al menos 30 minutos para garantizar que toda la solución de polímero se congele. Retire el disolvente de los moldes liofilizándolos durante la noche.NOTA: El color del polímero en el molde debe cambiar de claro a blanco después del proceso de liofilización. Para eliminar el material del molde de sacrificio, transfiera los moldes después del proceso de liofilización a un baño de agua desionizada de 5 L bajo una agitación suave. Reemplace el agua en el baño cuando se turbe. Cuando todo el BVOH se disuelva, seque al aire los andamios y guárdelos en una cámara de vacío hasta su uso. 2. Recubrimiento del andamio vascular con fibronectina Desinfecte los andamios vasculares PLLA:PLGA sumergiéndolos en etanol al 70% durante 30 min. Lavar los andamios 3x 5 min con PBS. Preparar una dilución de 50 μg/ml de fibronectina humana en PBS y recubrir los andamios. Mezclar 500 μL de solución de fibronectina madre (1 mg/ml) con 9,5 ml de PBS. Sumerja los andamios vasculares desinfectados en esta solución de fibronectina e incube a 37 °C durante 60 min para permitir la adsorción de proteínas. Después de la incubación, enjuague los andamios con PBS para eliminar la fibronectina no unida. Guarde estos andamios recubiertos a 4 °C durante un máximo de 1 semana. 3. Preparación de biotinta rhCollMA Prepare un tampón de fosfato para neutralizar el stock de biotinta ácida rhCollMA. Prepare un stock 10x de tampón de fosfato disolviendo 5.495 g de Na2HPO4, 1.55 g de NaH2PO4 y 30 mg de NaCl en 50 ml de agua desionizada. Prepare una dilución de 10 veces del tampón de fosfato 10x utilizando 1 parte de 10x tampón de fosfato con 9 partes de agua desionizada. Combine 900 μL de solución de rhCollMA madre con 100 μL de tampón de fosfato 10x para neutralizar la solución ácida de rhCollMA. Diluya la solución neutralizada de rhCollMA a la concentración deseada de 10 mg/ml mezclándola con la cantidad requerida de 1 tampón de fosfato.NOTA: La concentración de stock de rhCollMA varía entre lotes. Por lo tanto, el volumen de 1x tampón de fosfato necesario para alcanzar la concentración deseada variará. Preparar la solución porógena-fotoiniciadora (PEO-LAP) para combinarla con la rhCollMA neutra diluida. Preparar una solución al 1,6% (p/v) de poli(óxido de etileno) (PEO) en DMEM libre de fenol sin rojo disolviendo 160 mg de PEO en 10 ml de DMEM. Agregue 20 mg de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP) a esta solución para obtener 0,2% (p/v) de LAP en la solución. A partir de este punto, cubra la solución con papel de aluminio o manténgala en un lugar oscuro para protegerla de la luz. Esterilizar la solución PEO-LAP pasándola a través de un filtro de 0,22 μm. Guarde esta solución a 4 °C durante un máximo de 1 semana. Antes de la bioimpresión, mezcle la solución neutra diluida de rhCollMA con la solución PEO-LAP en una proporción de 1:1 para obtener la solución final de biotinta. Use pipeteo, en lugar de un vórtice, para mezclar las soluciones mientras evita las burbujas de aire. Si se introducen muchas burbujas en la solución, centrífuga a 2.000 × g durante 30 s. Después de la centrifugación, mezcle la solución de biotinta nuevamente para garantizar la homogeneidad. 4. Preparación del baño de soporte granular Prepare el material de soporte granular de gelatina. En un gabinete de seguridad biológica, divida el contenido de un tubo de 2 g de material de soporte liofilizado en dos tubos cónicos estériles de 50 ml, cada uno con aproximadamente 1 g. Agregue 40 ml de DMEM libre de fenol rojo frío (4 °C) a cada tubo y vórtice vigorosamente hasta que todo el material de soporte liofilizado se disuelva. Deje que la suspensión resultante se asiente a 4 °C para permitir que el material de soporte se rehidrate. Desgasifica el material de soporte en una cámara de vacío durante 30 minutos para reducir las burbujas. Centrifugar el material de soporte a 2.000 × g durante 5 min. Asegúrese de que el material esté en la parte inferior del tubo y que el sobrenadante esté claro. Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no aspirar el material de soporte en la parte inferior.NOTA: El material de soporte no debe fluir mientras se inclina el tubo después de retirar el sobrenadante. Si el material fluye, centrímelo de nuevo utilizando la misma configuración pero sin agregar un nuevo sobrenadante. Transfiera aproximadamente 4 ml del material de soporte preparado y compactado a cada pozo de una placa de 12 pocillos utilizando una pipeta de desplazamiento positivo. Golpee la placa del pozo en una superficie dura para forzar que el material de soporte se extienda uniformemente en el pozo.NOTA: El volumen mínimo recomendado de material de soporte es 3 veces el volumen de la construcción que se imprimirá en él. Coloque la placa del pozo con el material de soporte en una etapa de bioimpresora enfriada, o a 4 °C, hasta su uso para evitar que las partículas de gelatina se derritan. 5. Incorporación de células endoteliales y células de apoyo con la biotinta Prepare el medio de células endoteliales de acuerdo con las instrucciones del fabricante mezclando el medio basal con su componente de kit de medio correspondiente, incluida una solución antibiótica, suero bovino fetal y suplementos de crecimiento de células endoteliales. Prepare el medio de células madre de la pulpa dental combinando 500 ml de DMEM bajo en glucosa, 58 ml de suero fetal bovino, 5,8 ml de aminoácidos no esenciales (NEAA), 5,8 ml de sustituto de glutamina, 5,8 ml de 1 M DE HEPES y 5,8 ml de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina. Preparar una suspensión que contenga 2 × 106 células endoteliales microvasculares adiposas humanas que expresan ZsGreen1 (HAMEC-ZsGreen1) y 6 × 106 células madre de pulpa dental (DPSC) en 10 ml de medio de células endoteliales. Centrifugar la suspensión celular a 200 × g durante 4 min para obtener un pellet celular. Aspirar el medio sobrenadante. Resuspend el pellet celular en 1 mL de biotinta rhCollMA preparada previamente (que contiene PEO-LAP) para obtener una biotinta con una concentración celular total de 8 × 106 células por 1 mL de biotinta.PRECAUCIÓN: Después de combinar la biotinta con las células, proceda inmediatamente al siguiente paso. Si las células se dejan en la suspensión durante mucho tiempo, las células se hundirán en el fondo del tubo y su viabilidad se deteriorará. Para experimentos que no involucren células, omita los pasos 5.1-5.5 o incorpore perlas fluorescentes con la biotinta en lugar de células para una visualización microscópica mejorada de las construcciones impresas. Transfiera la mezcla de células y biotinta a cartuchos de impresión. Coloque una aguja de 0,22 mm de diámetro interno en un cartucho de impresión ámbar de 3 ml y coloque el cartucho en un tubo cónico de 50 ml. Transfiera 1 ml de la mezcla de células y biotinta al cartucho de impresión llenándolo desde la parte superior, utilizando una pipeta de desplazamiento positivo para reducir las burbujas. Instale el cartucho de impresión en la herramienta adecuada en la bioimpresora. 6. Bioimpresión de redes microvasculares utilizando biotinta rhCollMA Crear un diseño CAD 3D para la red microvascular bioimpresa. Esboza un patrón 2D de un cuadrado de 4 mm que contiene un canal circular de 2 mm de diámetro en su centro. Extruir el boceto en 4 mm para obtener un cubo de 4 mm x 4 mm x 4 mm con un canal central. Exporte este objeto como un archivo . Archivo STL. Importe una placa de 12 pocillos. Plantilla STL en la pestaña de modelado sólido en el software de corte de bioimpresora y colóquela en el área designada de la cama de impresión virtual. Importe el archivo . STL de la forma del cubo en la pestaña de modelado sólido en el software de corte de bioimpresora. Haga clic en la casilla de verificación Usar segmentación de datos externa | configure la segmentación de datos en la sección de propiedades del objeto . En la ventana emergente, elija un patrón rectilíneo para el patrón de relleno y escriba 30% en la densidad de relleno. Haga clic en aceptar. Coloque una copia de la forma del cubo en cada pozo virtual deseado haciendo clic en el cubo y moviéndolo con el mouse. Cree nuevos ajustes de material para la biotinta rhCollMA en la pestaña materiales del software de corte de bioimpresora haciendo clic en el botón Agregar material . Elija la configuración del material para imprimir. Para la presión, escriba 2 psi en el cuadro correspondiente. Para la velocidad, escriba 20 mm/s en el cuadro correspondiente.NOTA: Cada material de biotinta tiene sus propias configuraciones de impresión diferentes que se pueden guardar en la lista de materiales de la aplicación. Asigne los valores de ancho de línea y alto de línea a 0,24 mm y el valor de aceleración a 400 mm/s2, escribiendo estos valores en los cuadros correspondientes. En la pestaña modelado de sólidos , haga clic en el objeto de cubo y, a continuación, haga clic en el material rhCollMA de la sección de materiales para asignarlo a la forma del cubo. En la pestaña bioensamblaje , haga clic en el botón Enviar trabajo de impresión para enviar el trabajo de impresión a la bioimpresora. Cargue el cartucho de impresión cargado con la biotinta celular en la herramienta de dispensación neumática ambiental de 3 ml de la bioimpresora basada en extrusión 3D. Ajuste la temperatura de la cama de impresión a 4 °C haciendo clic en el botón de enfriamiento debajo de la pestaña Control-Calentamiento/Enfriamiento en la pantalla de la interfaz de la bioimpresora. Cargue la placa con el baño de soporte en la cama de la impresora.NOTA: La configuración del material para la presión y la velocidad de impresión pueden cambiar debido a las diferencias en la temperatura ambiente o la variabilidad del lote de biotinta. Por ejemplo, en los días más fríos, se necesita una presión más alta o una velocidad más lenta para extruir la misma cantidad de material. En la pestaña de impresión de la pantalla de la interfaz de la bioimpresora, haga clic en el trabajo de impresión enviado en el paso 6.7. y haga clic en Iniciar | ir para comenzar el trabajo de impresión. Después de imprimir, exponga la placa del pozo a una fuente de luz de 405 nm con una intensidad de 3 mW / cm2 durante 30 s para iniciar la reticulación de la biotinta rhCollMA. Después de la reticulación, incube la placa del pozo a 37 ° C y 5% de CO2 durante al menos 20 minutos hasta que todo el baño de soporte se derrita. Aspire suavemente el baño de soporte licuado y reemplácelo con un medio de células endoteliales. Incubar las construcciones a 37 °C y 5% de CO2 hasta su uso en pasos posteriores.NOTA: Debido a la contracción de la construcción después de la impresión, se recomienda realizar el ensamblaje Paso 7 el mismo día que el Paso 6. 7. Montaje de la red microvascular bioimpresa con el andamio vascular para obtener el colgajo vascularizado diseñado Inmediatamente después de la extracción del material de soporte de la red microvascular bioimpresa, coloque un andamio vascular PLLA:PLGA recubierto de fibronectina en el canal principal de la estructura bioimpresa. Incubar las construcciones ensambladas a 37 °C y 5% de CO2 durante 2 días. Revestir la luz del andamio vascular con células endoteliales. Preparar una suspensión celular de células endoteliales microvasculares adiposas humanas que expresan tdTomato (HAMEC-tdTomato) a una concentración de 1 × 107 células/ml. Coloque una gota de 20 μL de esta suspensión celular sobre una superficie hidrofóbica (es decir, un plato de 10 cm de cultivo no tisular [nonTC]). Coloque suavemente los andamios vasculares en la parte superior de la gota, de modo que la luz del andamio en un extremo haga contacto con la gota celular. Aspirar la gota desde el extremo opuesto del andamio (es decir, el extremo que no está en contacto con la gota), llenando su luz con la suspensión celular. Coloque el andamio sembrado en un tubo de microcentrífuga y colóquelo en un rotador dentro de una incubadora humidificada durante 60 minutos. A continuación, transfiera el andamio a una placa de 12 pocillos y agregue 2 ml de medio de células endoteliales. Cultive los colgajos diseñados durante 7 días, mientras reemplaza el medio cada 2 días con un medio de células endoteliales frescas. 8. Microscopía confocal y tinción por inmunofluorescencia de los colgajos diseñados Después de 4 días y 7 días de cultivo, realice imágenes de células vivas de los andamios ensamblados utilizando un microscopio de escaneo láser confocal. Defina los canales de fluorescencia para las proteínas fluorescentes ZsGreen1 y tdTomato en el software de adquisición de imágenes del microscopio. Elija un objetivo 5x/0.16 con zoom de 0.5x (tamaño de píxel 5 μm) y defina una pila Z con 22 cortes con un grosor de 41 μm cada uno. Defina un escaneo de mosaico de 3 x 2 para obtener una imagen y capture toda la construcción. Ajuste la intensidad del láser y los valores de ganancia para obtener una señal fluorescente clara sin saturación y un fondo mínimo y adquiera las imágenes. Realice una proyección de máxima intensidad de la pila Z adquirida para obtener una sola imagen 2D utilizando el software de adquisición de imágenes de microscopio o un software de análisis de imágenes similar. Realice imágenes de mayor aumento de una región de interés. Cambie a una lente de objetivo 10x/0.3 con zoom de 0.5 (tamaño de píxel 1.25 μm) y defina una pila Z con 9 cortes de grosor de 41 μm. Realice los pasos 8.2.-8.3. Después de 7 días de cultivo, fije los colgajos diseñados sumergiéndolos en paraformaldehído al 4% durante 20 min. Lave las construcciones 3x 5 min con PBS. Agregue 0.3% (v / v) Triton-X en PBS a las construcciones e incube durante 15 min a temperatura ambiente para permeabilizar las células. Lave las construcciones 3x 5 min con PBS. Prepare una solución de bloqueo disolviendo al 5% (p/v) albúmina sérica bovina (BSA) en PBS. Agregue la solución de bloqueo a las solapas de ingeniería e incube durante 1 h a temperatura ambiente. Prepare la solución primaria de anticuerpos diluyendo el anticuerpo 1:50 de actina anti-músculo liso (anti-SMA) de ratón en la solución de BSA al 5% preparada previamente para teñir las células de soporte que expresan SMA. Incubar los andamios en la solución primaria de anticuerpos durante la noche a 4 °C. Lavar 3x 5 min con PBS. Preparar la solución secundaria de anticuerpos diluyendo el anticuerpo IgG 1:400 de cabra conjugada con Cy3 y el anticuerpo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 2,5 μg/mL) en PBS. Aplique la solución secundaria de anticuerpos a los andamios e incube durante 3 h a temperatura ambiente. Lavar 3x 5 min con PBS. Almacene las construcciones a 4 °C en PBS durante un máximo de 1 mes. Tome una imagen de los andamios teñidos utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Defina los tres canales de fluorescencia (DAPI, ZsGreen y Cy3) en el software de adquisición de imágenes del microscopio. Defina una pila Z con un espesor de sección de 2 μm que abarque un espesor total de 50 μm. A continuación, defina un escaneo de mosaico para obtener imágenes de áreas más grandes de la construcción. Ajuste los parámetros de adquisición para obtener una señal fluorescente clara sin saturación y con un fondo mínimo. Adquiera las imágenes utilizando el objetivo 20x/0.8 con zoom 1.0x (tamaño de píxel 0.31 μm). Realice una proyección de máxima intensidad de la pila Z adquirida para obtener una sola imagen 2D utilizando el software de adquisición de imágenes de microscopio o un software de análisis de imágenes similar. 9. Anastomosing the engineered flap directly to a rat’s femoral artery using a cuff technique Prepare y esterilice (autoclave) las siguientes herramientas quirúrgicas: bisturí No. 15, un par de pinzas de dientes finos y un pequeño par de tijeras con mango de anillo. Además, prepare y esterilice las siguientes herramientas microquirúrgicas: un fórceps de joyero No. 3 recto y puntiagudo fino, pinzas de joyero en ángulo, un soporte de aguja de mango redondo con mandíbulas curvas, un par de dilatadores de vasos, tijeras de disección, tijeras adventicias, así como abrazaderas de vasos con su aplicador. Preparar una solución de solución salina heparinizada de 100 UI/ml diluyendo 5 ml de solución de heparina madre con 195 ml de solución salina. Cortar y esterilizar los puños de poliimida. Cortar secciones de 2,5 mm de un tubo de poliimida bajo un microscopio de disección. En un extremo de cada sección, haga una incisión longitudinal de 1,25 mm en la pared del tubo para obtener un mango de manguito. Haga un corte en ángulo en el otro extremo del tubo para facilitar la eversión del vaso. Sumergir los puños en etanol al 70% seguido de dos lavados con solución salina heparinizada. Prepare una rata Sprague-Dawley macho (275-350 g) para la cirugía. Siete días antes de la cirugía, comience a administrar una dosis diaria subcutánea de ciclosporina (10 mg kg-1) para lograr la supresión inmune. Antes de la cirugía, anestesiar al animal utilizando la inhalación de isoflurano al 3% de acuerdo con el POE institucional utilizando una cámara de inducción. Verifique la anestesia profunda pellizcando ambos pies y verificando si hay reflejos. Administrar una dosis subcutánea de buprenorfina analgésica (0,03 mg kg-1) y heparina anticoaguladora (200 UI kg-1). Aplique un ungüento lubricante para los ojos del animal para prevenir la deshidratación. Afeitar el área quirúrgica de la rata y desinfectar el sitio con yodo y luego etanol al 70%. Asegure las extremidades del animal a la mesa con cinta adhesiva. Exponer y aislar la arteria femoral común. Haga una incisión oblicua de 2 cm de largo a través de la piel, a lo largo de la concavidad entre la pierna y el abdomen. Usando fórceps y tijeras de punta roma, libere la piel del tejido subyacente para visualizar la almohadilla de grasa inguinal. Usando tijeras y fórceps, corte a través de la almohadilla de grasa alrededor de los márgenes superior, medial e inferior. Preste atención a no cortar vasos grandes debajo de la almohadilla de grasa. Refleje la almohadilla de grasa lateralmente, dejando intactos los vasos epigástricos. Coloque una gasa húmeda en la almohadilla de grasa reflejada para evitar que se seque y colóquela en su lugar. Asegúrese de que los vasos femorales comunes sean visibles.NOTA: La almohadilla de grasa se utilizará más tarde para aplicar presión suave a las anastomosis. Exponga la arteria femoral desde el ligamento inguinal proximalmente hasta el punto de ramificación de la arteria epigástrica distalmente extrayéndola de su vaina.PRECAUCIÓN: Por lo general, hay una rama de la arteria femoral que corre debajo de ella, comúnmente llamada rama de Murphy. Preste atención a no dañar esta rama difícil de ver. Divida la rama de Murphy ligiéndola y luego ligar la arteria femoral con dos ligaduras en el centro de la arteria espaciadas a 1 mm de distancia. Mantenga un extremo de la sutura de la ligadura largo para usarlo más tarde para tirar del extremo del vaso a través del manguito. Corte la arteria entre las dos ligaduras usando tijeras adventicias.PRECAUCIÓN: No debe haber sangrado al realizar este corte. Si el extremo arterial sangra, pinza la arteria y vuelva a aplicar una ligadura. Usando el extremo largo de la sutura de ligadura, inserte cada extremo del vaso en un manguito de poliimida, como se preparó en el paso anterior, de modo que los mangos de los dos puños apunten uno lejos del otro. Después de la inserción, aplique una abrazadera simultáneamente en el mango del manguito y el recipiente, asegurando el manguito en su lugar. Prepare una solución salina heparinizada en una jeringa equipada con una aguja de 27 G. Tire del extremo del vaso ligado y córtelo cerca de la ligadura. Lave inmediatamente el extremo del vaso a fondo con la solución salina heparinizada hasta que no se vea sangre en la luz.PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el extremo del vaso se lave bien, ya que cualquier sangre que quede en el interior formará un coágulo, que se introducirá en el torrente sanguíneo al completar el procedimiento. Esto podría conducir a la oclusión del vaso y la pérdida de perfusión en la pierna. Expanda la luz del recipiente sosteniéndolo por su vaina con una mano y dilatando su luz con el dilatador del vaso con la otra mano. Coloque una sutura circunferencial de polipropileno 6-0 suelta alrededor del cuerpo del manguito. El vaso termina usando dos dilatadores de vasos sobre el cuerpo del manguito y lo asegura en su lugar apretando la sutura circunferencial.NOTA: Si alguna sangre se filtra a través del vaso sujetado durante las manipulaciones, lave bien la luz con solución salina heparinizada. Enjuague el colgajo diseñado con solución salina heparinizada y luego inserte el manguito forrado de vasos en la luz del andamio vascular. Fije el andamio en su lugar colocando una sutura de polipropileno circunferencial 6-0 alrededor del andamio y el cuerpo del manguito. Haga este paso para ambos lados del andamio vascular. Envuelva un filtro de membrana de poliestireno de 0,2 μm alrededor del sitio de las anastomosis para aislar el colgajo diseñado del tejido circundante. Suelte primero la abrazadera distal; luego, suelte la pinza proximal para restablecer el flujo sanguíneo a través del vaso. Para detener cualquier sangrado a través de las anastomosis, refleje la almohadilla de grasa sobre los vasos femorales y aplique una presión suave con una gasa estéril durante 3 minutos. Sutura la almohadilla de grasa en su lugar con polipropileno 6-0; luego, sutura la piel usando suturas absorbibles 5-0 PGA. Limpie el área de la herida con solución salina y aplique solución de yodo. Para el dolor postoperatorio y el manejo de animales, prepare un 0.1% (v / v) de tramadol en agua potable. Además, administrar una dosis diaria de heparina (200 UI kg-1) y ciclosporina (10 mg kg-1). Coloque al animal en una jaula limpia colocada sola debajo de una lámpara de calefacción. Continúe monitoreando al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal.