3Dプリンティング技術を用いた血管フラップの作製

すべての動物処置は、テクニオン前臨床研究局(PCRAテクニオン、倫理承認番号058-05-20)の監督下で承認され、実施された。雄のSprague-Dawleyラット(275〜350g)をこれらの研究に使用した。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料表 を参照してください。 1. 血管足場製作 コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、所望の血管足場形状の3Dコンピュータモデルを作成するか、オンラインリポジトリから所望の血管構造の3Dファイルをダウンロードする。 内径0.9mm、外径2mm、高さ18mmの円柱を作成します。シリンダー壁の横に直径 0.22 mm の放射状の窓ガラスを追加します。 3D 設計ソフトウェアを使用して足場の金型を作成し、 としてエクスポートします。STL ファイルです。次に、後で金型の充填を容易にするために、設計に漏斗を追加します。 をインポートします。溶融蒸着モデリング(FDM)3Dプリンタ用のスライスソフトウェアにSTLファイル。レイヤーの高さが 0.1 mm のモデルをスライスし、.gcode として書き出すか、3D プリンターに直接送信します。 水溶性ブテン – ジオールビニルアルコール共重合体(BVOH)フィラメントを使用して、0.25mmノズルを備えたFDM 3Dプリンタで金型を3D印刷します。印刷された金型は、使用時まで真空チャンバーに保管してください。警告: BVOH フィラメントは湿気に敏感であるため、素手での取り扱いは避けてください。さらに、湿気にさらされないようにフィラメントを真空チャンバに保管することをお勧めします。 1,4-ジオキサン中のポリ-L-乳酸(PLLA)とポリ乳酸-コ-グリコール酸(PLGA)の1:1混合物のポリマー溶液を調製する。 350 mg の PLLA および 350 mg の PLGA の重量を量り、20 mL のガラスバイアルに移します。 10 mLの1,4-ジオキサンを測定し、ガラスピペットを使用してガラスバイアルに移す。ガラスバイアルに小さな磁気攪拌子を加える。警告: 1,4-ジオキサンは危険な有機溶媒です。適切な個人用安全装置を使用し、ヒュームフード内で作業してください。 ガラスバイアルを70°Cに加熱した温水浴の中に置き、すべてのポリマーが完全に溶解するまで内容物を一晩混合する。使用時まで、溶液を気密ガラス容器に保管してください。 BVOH金型にPLLA:PLGAソリューションを充填します。 容積ピペットを使用して、30 μLのポリマー溶液を測定し、金型に充填します。注:金型を充填するために必要な体積は、設計された容器の体積に応じて変化します。金型の漏斗が完全に充填されるまでポリマー溶液を加え続けます。 金型を100 × g で2分間遠心分離する。さらに20μLのポリマー溶液を金型に補充して、完全な充填を確保します。 充填された金型を-80°Cで少なくとも30分間凍結して、すべてのポリマー溶液が凍結することを確認します。金型から溶媒を一晩凍結乾燥することによって除去する。注:金型内のポリマーの色は、凍結乾燥プロセス後に透明から白に変わるはずです。 犠牲型材料を除去するために、凍結乾燥処理後の型を穏やかに攪拌しながら5L脱イオン水浴に移す。お風呂の水が曇ったら交換してください。すべてのBVOHが溶解したら、足場を風乾し、使用時まで真空チャンバーに保管してください。 2.血管足場をフィブロネクチンでコーティングする PLLA:PLGA血管足場を70%エタノールに30分間浸漬して消毒します。 足場をPBSで3x 5分間洗う。 PBS中の50μg/mLヒトフィブロネクチンの希釈液を調製し、足場をコーティングする。 500 μL のストックフィブロネクチン溶液 (1 mg/mL) を 9.5 mL の PBS と混合します。 消毒した血管足場をこのフィブロネクチン溶液に浸し、タンパク質吸着を可能にするために37°Cで60分間インキュベートする。 インキュベーション後、足場をPBSですすぎ、未結合のフィブロネクチンを除去した。これらのコーティングされた足場を4°Cで最大1週間保管してください。 3. rhCollMAバイオインク調製 酸性rhCollMAバイオインクストックを中和するためのリン酸緩衝液を調製する。 5.495 gのNa2 HPO 4、1.55 gのNaH2 PO4、および30 mgのNaClを50 mLの脱イオン水に溶解して、リン酸緩衝液の10倍ストックを調製する。 10倍リン酸緩衝液の1部と9部の脱イオン水を組み合わせて、10倍原液リン酸緩衝液の10倍希釈液を調製する。 900 μL のストック rhCollMA 溶液と 100 μL の 10x リン酸緩衝液を組み合わせて、酸性 rhCollMA 溶液を中和します。 中和したrhCollMA溶液を、必要量の1xリン酸緩衝液と混合して、所望の濃度の10mg/mLに希釈する。注:rhCollMAのストック濃度はロットによって異なります。したがって、所望の濃度に達するのに必要な1xリン酸緩衝液の容量は変化するであろう。 希釈した中性rhCollMAと組み合わせるためにポロゲン – 光開始剤溶液(PEO-LAP)を調製する。 160mgのPEOを10mLのDMEMに溶解して、フェノールレッドを含まないDMEM中のポリ(エチレンオキシド)(PEO)の1.6%(w / v)溶液を調製する。 この溶液に20mgのフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)を加え、溶液中に0.2%(w/v)LAPを得た。この時点から、溶液をアルミホイルで覆うか、暗い場所に保管して光から保護してください。 PEO-LAP 溶液を 0.22 μm フィルターに通して滅菌します。この溶液を4°Cで最大1週間保存する。 バイオプリンティングの前に、希釈した中性rhCollMA溶液とPEO-LAP溶液を1:1の比率で混合し、最終的なバイオインク溶液を得た。渦ではなくピペッティングを使用して、気泡を避けながら溶液を混合します。 溶液に多くの気泡が導入された場合は、2,000 × g で30秒間遠心分離します。遠心分離後、均一性を確保するためにバイオインク溶液を再び混合する。 4.粒状サポート入浴剤 ゼラチン粒状担体材料を調製する。 生物学的安全キャビネット内で、凍結乾燥担体材料の1つの2gチューブの内容物を、それぞれ約1gを含む2つの滅菌50mL円錐形チューブに分割する。 40mLの冷(4°C)フェノールレッドフリーDMEMを各チューブに加え、凍結乾燥担体材料がすべて溶解するまで激しく渦巻き込んだ。 得られたスラリーを4°Cに座らせて、担体材料が再水和できるようにします。 真空チャンバ内の支持材料を30分間減圧して気泡を低減させる。 サポート材料を2,000 × g で5分間遠心分離する。材料がチューブの底にあり、上清が透明であることを確認します。 上部の支持材を吸引しないように注意しながら、上清を吸引する。注:サポート材料は、上清を除去した後にチューブを傾けている間は流れてはなりません。材料が流れた場合は、新しい上清を追加せずに、同じ設定を使用して再度遠心分離します。 調製し、圧縮した担体材料の約4mLを、容積ピペットを用いて12ウェルプレートの各ウェルに移す。硬い表面のウェルプレートをタップして、サポート材料がウェル内に均等に広がるように強制します。メモ: サポート資料の最小推奨容量は、印刷されるコンストラクトの体積の 3 倍です。 ゼラチン粒子が融解するのを防ぐために、担体材料を含むウェルプレートを冷却されたバイオプリンターステージ上、または4°Cで、その使用まで置く。 5. バイオインクによる内皮細胞および支持細胞の組み込み 抗生物質溶液、ウシ胎児血清、および内皮細胞増殖サプリメントを含む、基礎培地を対応する培地キットコンポーネントと混合することによって、製造業者の指示に従って内皮細胞培地を調製する。 500 mL の低グルコース DMEM、58 mL のウシ胎児血清、5.8 mL の非必須アミノ酸 (NEAA)、5.8 mL のグルタミン代替物、5.8 mL の 1 M HEPES、および 5.8 mL のペニシリン – ストレプトマイシン – ナイスタチン溶液を組み合わせて歯髄幹細胞培地を調製する。 2×106個の ZsGreen1発現ヒト脂肪微小血管内皮細胞(HAMEC-ZsGreen1)および6個×106個の 歯髄幹細胞(DPSC)を含む懸濁液を10mLの内皮細胞培地に調製する。 細胞懸濁液を200× g で4分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。上清培地を吸引する。 細胞ペレットを、以前に調製した1mLのrhCollMAバイオインク(PEO−LAPを含む)に再懸濁し、バイオインク1mL当たり8×106 個の総細胞濃度を有するバイオインクを得た。警告: バイオインクを細胞と組み合わせたら、すぐに次のステップに進んでください。細胞が懸濁液中に長時間放置されると、細胞はチューブの底に沈み、その生存率は悪化する。細胞を含まない実験の場合は、ステップ5.1〜5.5をスキップするか、細胞の代わりにバイオインクに蛍光ビーズを組み込んで、印刷された構築物の顕微鏡的視覚化を強化します。 細胞 – バイオインク混合物を印刷カートリッジに移す。 内径 0.22 mm の針を 3 mL の琥珀色の印刷カートリッジに合わせ、カートリッジを 50 mL の円錐形のチューブに入れます。 1mLの細胞 – バイオインク混合物を上から充填することによって印刷カートリッジに移し、正の置換ピペットを使用して気泡を減少させる。 印刷カートリッジをバイオプリンターの適切なツールに取り付けます。 6. rhCollMAバイオインクを用いたマイクロ血管ネットワークのバイオプリンティング バイオプリントされた微小血管ネットワーク用の3D CAD設計を作成します。 中央に直径 2 mm の円形チャンネルを含む 4 mm 角の 2D パターンをスケッチします。スケッチを 4 mm 押し出して、中央チャンネルのある 4 mm x 4 mm x 4 mm の立方体を取得します。このオブジェクトを としてエクスポートします。STL ファイルです。 12 ウェルプレートをインポートします。STLテンプレートをバイオプリンタスライスソフトウェアの ソリッドモデリング タブに入れ、仮想プリントベッドの指定された領域に配置します。 をインポートします。立方体形状のSTLファイルをバイオプリンタスライスソフトウェアのソリッドモデリングタブに入れる。[外部スライサーを使用]チェックボックスをクリック|オブジェクトのプロパティセクションでスライサーを構成します。ポップアップウィンドウで、塗りつぶしパターンの直線パターンを選択し、塗りつぶし密度に「30%」と入力します。[同意する] をクリックします。 立方体図形のコピーを目的の各仮想井戸に配置するには、立方体をクリックし、マウスを使用して移動します。 バイオプリンタースライスソフトウェアの「材料」タブで「 材料 の追加」ボタンをクリックして、rhCollMAバイオインクの新しい 材料 設定を作成します。印刷するマテリアルの設定を選択します。 圧力の場合は、対応するボックスに 「2 psi」 と入力します。 速度の場合は、対応するボックスに 「20 mm/s」 と入力します。注:各バイオインク材料には、アプリケーションの材料リストに保存できる独自の異なる印刷設定があります。 線幅と線の高さの値を 0.24 mm、加速度の値を 400 mm/秒2 に割り当てます。これらの値を対応するボックスに入力します。 ソリッド モデリング タブで、立方体オブジェクトをクリックし、材料セクションから rhCollMA マテリアルをクリックして立方体形状に割り当てます。バイオアセンブリタブで、印刷ジョブの送信ボタンをクリックして、印刷ジョブをバイオプリンターに送信します。 セルラーバイオインクを装填した印刷カートリッジを、3D押出ベースのバイオプリンタの3mL周囲空気圧ディスペンスツールにロードします。 バイオプリンターインターフェイス画面の[制御 – 加熱/冷却]タブの下にある冷却ボタンをクリックして、プリントベッドの温度を4°Cに設定します。サポートバスの入ったプレートをプリンタベッドに積み込みます。注:印刷圧力と印刷速度に関する材料の設定は、周囲温度の違いやバイオインクバッチの変動により変更される場合があります。たとえば、寒い日には、同じ量の材料を押し出すためにより高い圧力またはより遅い速度が必要です。 バイオプリンターインターフェース画面の印刷タブで、ステップ 6.7 で送信された 印刷 ジョブをクリックします。をクリックし、[ 開始] |クリック して印刷ジョブを開始します。 印刷後、ウェルプレートを3mW/cm2 の強度を有する405nmの光源に30秒間露光し、rhCollMAバイオインクの架橋を開始した。 架橋後、ウェルプレートを37°Cおよび5%CO2 で、すべての支持浴が溶けるまで少なくとも20分間インキュベートする。 液化した支持浴を穏やかに吸引し、内皮細胞培地と交換する。さらなるステップで使用するまで、構築物を37°Cおよび5%CO2 でインキュベートする。メモ: 印刷後に構造が収縮するため、ステップ 6 と同じ日にアセンブリステップ 7 を実行することをお勧めします。 7.バイオプリントされた微小血管網を血管足場で組み立てて、操作された血管化フラップを得る バイオプリントされた微小血管網の担体材料除去の直後に、バイオプリント構造のメインチャネルにフィブロネクチンコーティングされたPLLA:PLGA血管足場を置く。 組み立てた構築物を37°Cおよび5%CO2で2 日間インキュベートする。 血管足場の内腔を内皮細胞で整列させる。 tdトマト発現ヒト脂肪微小血管内皮細胞(HAMEC−tdトマト)の細胞懸濁液を1×107 細胞/mLの濃度で調製する。 この細胞懸濁液の20μLの液滴を疎水性表面(すなわち、非組織培養物[nonTC]10cmディッシュ)に置く。 一端の足場の内腔が細胞液滴と接触するように、血管足場を液滴の上に静かに置く。 足場の対向する端(すなわち、液滴に接触していない端部)から液滴を吸引し、その内腔を細胞懸濁液で満たす。 播種した足場を微量遠心チューブに入れ、加湿インキュベーター内の回転子に60分間入れます。次に、足場を12穴プレートに移し、2mLの内皮細胞培地を加える。 操作したフラップを7日間培養し、2日ごとに培地を新鮮な内皮細胞培地に交換しながら培養する。 8. 人工フラップの共焦点顕微鏡および免疫蛍光染色 培養の4日後および7日後、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて組み立てた足場の生細胞イメージングを行う。 ZsGreen1およびtdTomato蛍光タンパク質の蛍光チャネルを顕微鏡画像取得ソフトウェアで定義します。 ズーム 0.5 倍 (ピクセル サイズ 5 μm) の 5 倍/0.16 対物レンズを選択し、それぞれ厚さ 41 μm のスライスを 22 枚含む Z スタックを定義します。 3 x 2 タイル スキャンを定義して、構成体全体をイメージし、キャプチャします。 レーザー強度とゲイン値を調整して、彩度がなく背景が最小限に抑えられたクリアな蛍光シグナルを取得し、画像を取得します。 取得したZスタックの最大強度投影を行い、顕微鏡画像取得ソフトウェアまたは類似の画像解析ソフトウェアを用いて単一の2D画像を取得する。 関心領域の高倍率イメージングを実行します。 0.5ズーム(ピクセルサイズ1.25μm)の10x/0.3対物レンズに切り替え、厚さ41μmの9スライスのZスタックを定義します。 手順 8.2.-8.3 を実行します。 7日間の培養後、操作されたフラップを4%パラホルムアルデヒドに20分間沈めて固定します。 コンストラクトをPBSで3x 5分間洗浄する。 PBS中の0.3%(v/v)Triton-Xを構築物に加え、室温で15分間インキュベートして細胞を透過処理する。 コンストラクトをPBSで3x 5分間洗浄する。 PBSに5%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を溶解してブロッキング溶液を調製する。ブロッキング溶液を操作されたフラップに加え、室温で1時間インキュベートする。 マウス抗平滑筋アクチン(抗SMA)抗体を予め調製した5%BSA溶液で1:50に希釈して一次抗体溶液を調製し、SMA発現支持細胞を染色した。 足場を一次抗体溶液中で4°Cで一晩インキュベートする。 PBSで3x 5分洗う。 Cy3結合ヤギ抗マウスIgG 1:400抗体および4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、2.5μg/mL)をPBSで希釈して二次抗体溶液を調製する。 二次抗体溶液を足場に塗布し、室温で3時間インキュベートする。 PBSで3x 5分洗う。 コンストラクトをPBS中の4°Cで最大1ヶ月間保存する。 染色された足場を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像化する。 顕微鏡画像取得ソフトウェアで3つの蛍光チャンネル(DAPI、ZsGreen、およびCy3)を定義します。 断面厚さ 2 μm で、総厚さ 50 μm の Z スタックを定義します。次に、タイル スキャンを定義して、構成体のより大きな領域をイメージします。 集録パラメータを調整して、飽和がなくバックグラウンドを最小限に抑えた明確な蛍光シグナルを取得します。 1.0倍ズーム(ピクセルサイズ0.31μm)で20x/0.8対物レンズを使用して画像を取得します。 取得したZスタックの最大強度投影を行い、顕微鏡画像取得ソフトウェアまたは類似の画像解析ソフトウェアを用いて単一の2D画像を取得する。 9.袖口技術を使用して、操作されたフラップをラットの大腿動脈に直接吻合する 次の手術器具を準備して滅菌します:15番メス、一対の細かい歯の鉗子、および小さな一対のリングハンドルハサミ。さらに、次の顕微手術用具を準備して滅菌します:まっすぐに細い尖ったNo.3宝石商の鉗子、角度の付いた宝石商の鉗子、湾曲した顎を持つ丸いハンドルの針ホルダー、一対の血管拡張器、解剖はさみ、アドベンティアはさみ、およびアプリケーター付きの血管クランプ。 5 mLのストックヘパリン溶液を195 mLの生理食塩水で希釈することによって、100 IU/mLのヘパリン化生理食塩水の溶液を調製する。 ポリイミドの袖口を切断して滅菌します。 ポリイミドチューブの2.5mm切片を解剖顕微鏡下で切断する。 各セクションの一端で、チューブの壁に縦方向に1.25mmの切開を行い、カフハンドルを得る。チューブのもう一方の端に角度の付いた切断を行い、血管の反転を容易にします。 袖口を70%エタノールに浸し、続いてヘパリン化生理食塩水で2回洗浄する。 手術のために雄のスプレイグ・ドーリーラット(275〜350g)を準備する。 手術の7日前に、免疫抑制を達成するためにシクロスポリン(10mgkg-1)の皮下1日用量の投与を開始する。 手術前に、誘導チャンバーを用いた施設SOPによる3%イソフルラン吸入を用いて動物を麻酔する。両足をつまんで反射神経を確かめて深い麻酔を確かめます。 鎮痛薬ブプレノルフィン(0.03mg kg-1)および抗凝固ヘパリン(200IU kg-1)の皮下用量を投与する。 脱水を防ぐために動物の目に潤滑眼軟膏を塗布する。 ラットの外科領域を剃り、ヨウ素と70%エタノールで部位を消毒する。粘着テープを使用して動物の手足をテーブルに固定します。 一般的な大腿動脈を露出させ、隔離する。 脚と腹部の間の凹みに沿って、皮膚を通して2cmの長さの斜めの切開を行う。 鉗子と鈍い端のはさみを使用して、下層組織から皮膚を解放し、鼠径部脂肪パッドを視覚化します。 はさみと鉗子を使用して、上、内側、および下の余白の周りの脂肪パッドを右に切ります。脂肪パッドの下で大きな容器を切らないように注意してください。 脂肪パッドを横方向に反射し、上腹部血管をそのまま残す。濡れたガーゼを反射脂肪パッドの上に置き、乾燥を防ぎ、所定の位置に固定します。一般的な大腿骨血管が見えるようにする。注:脂肪パッドは、後で吻合部に柔らかい圧力をかけるために使用されます。 鼠径靭帯から上腹部動脈分岐点に近接した大腿動脈を鞘から抜いて遠位に露出させる。注意:通常、大腿動脈の枝がその下に走っており、一般にマーフィーの枝と呼ばれています。この見にくい枝を傷つけないように注意してください。 マーフィーの枝を結紮して分割し、動脈の中央に1mm間隔をあけて2つの結紮で大腿動脈を結紮する。結紮縫合糸の一端を長く保ち、後で袖口を通して血管端を引っ張るために使用する。 2つの結紮状の間の動脈を外気性はさみを使用して切断する。警告:このカットを行う際に出血があってはなりません。動脈端が出血した場合は、動脈をクランプし、結紮を再適用する。 合字縫合糸の長い端を使用して、前のステップで準備したように、各容器の端部をポリイミドカフに挿入し、2つのカフのハンドルが互いに離れるようにします。 挿入後、カフハンドルと容器に同時にクランプを取り付け、カフを所定の位置に固定します。 27G針を備えたシリンジにヘパリン処理生理食塩水を調製する。 結紮した血管の端を引っ張り、結紮の近くで切断する。血管端部をヘパリン処理した生理食塩水で直ちに十分に洗浄し、内腔に血液が見えなくなるまで洗浄する。警告: 内部に残った血液は血栓を形成し、手順を完了すると血流に導入されるため、血管端がよく洗われていることを確認してください。これは、血管の閉塞および脚への灌流の喪失につながる可能性がある。 片手で鞘で保持し、もう片方の手で血管拡張器で内腔を拡張することによって、血管の内腔を広げる。 ゆるい6-0ポリプロピレンの円周縫合糸を袖口本体の周囲に置きます。袖口本体の上に2つの血管拡張器を使用して血管端をエバートし、円周縫合糸を締め付けることによって所定の位置に固定する。注:操作中にクランプされた血管から血液が漏れた場合は、ヘパリン処理した生理食塩水で内腔を徹底的に洗ってください。 操作されたフラップをヘパリン処理した生理食塩水ですすぎ、血管裏打ちされた袖口を血管足場の内腔に挿入する。足場と袖口本体の周りに円周状の6-0ポリプロピレン縫合糸を配置して、足場を所定の位置に固定します。血管足場の両側に対してこのステップを行う。 0.2 μmのポリスチレンメンブレンフィルターを吻合部位に巻き付けて、操作されたフラップを周囲の組織から分離します。 最初に遠位クランプを解除します。次に、近位クランプを解除して、血管を通る血流を再確立する。 吻合部を通る出血を止めるには、脂肪パッドを大腿骨血管に反射させ、滅菌ガーゼを使用して3分間穏やかな圧力をかけます。 6-0ポリプロピレンを使用して脂肪パッドを所定の位置に縫合する。次いで、5〜0個のPGA吸収性縫合糸を用いて皮膚を縫合する。 創傷領域を生理食塩水できれいにし、ヨウ素溶液を塗布する。 術後の疼痛および動物管理のために、飲料水中に0.1%(v / v)のトラマドールを調製する。さらに、ヘパリン(200IUKG-1)およびシクロスポリン(10mg kg-1)の1日用量を投与する。 動物を加熱ランプの下に置いた清潔なケージに単身で置きます。動物が胸骨の臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を監視し続けます。