ייצור דשים וסקולריים מהונדסים באמצעות טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו ונערכו בהנחיית הרשות למחקר פרה-קליני בטכניון (PCRA Technion, אישור אתיקה מס’ 058-05-20). זכרי חולדות ספראג-דאולי (275-350 גרם) שימשו למחקרים אלה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה. 1. ייצור פיגום כלי דם צור מודל ממוחשב תלת-ממדי של צורת פיגום כלי הדם הרצויה באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD) או הורד קובץ תלת-ממדי של מבנה כלי דם רצוי ממאגרים מקוונים. צור גליל עם קוטר פנימי של 0.9 מ”מ, קוטר חיצוני של 2 מ”מ, וגובה של 18 מ”מ. הוסיפו פנסטרציות רדיאליות בקוטר של 0.22 מ”מ לצד דופן הצילינדר. צור תבנית עבור הפיגום באמצעות תוכנת העיצוב התלת-ממדית וייצא אותה כ- . קובץ STL. לאחר מכן, הוסף משפך לעיצוב כדי להקל על מילוי התבנית מאוחר יותר. ייבא את . קובץ STL לתוכנת החיתוך עבור מדפסת התלת-ממד של מידול תצהיר מתמזג (FDM). פרוס את הדגם עם גובה שכבה של 0.1 מ”מ, וייצא אותו כ- .gcode או שלח אותו ישירות למדפסת התלת-ממד. הדפסה תלת-ממדית של התבנית במדפסת FDM 3D המצוידת בזרבובית 0.25 מ”מ, תוך שימוש בקופולימר אלכוהול ויניל ויניל (BVOH) מסיס במים. אחסנו את התבניות המודפסות בתא ואקום עד לשימוש.אזהרה: הימנעו מטיפול בחוט ה-BVOH בידיים חשופות מכיוון שהוא רגיש ללחות. בנוסף, מומלץ לאחסן את החוט בתא ואקום כדי למנוע חשיפה ללחות. הכינו תמיסת פולימר של תערובת 1:1 של חומצה פולי-L-לקטית (PLLA) וחומצה פולילקטית-קו-גליקולית (PLGA) ב-1,4-דיוקסן. שוקלים 350 מ”ג PLLA ו-350 מ”ג PLGA ומעבירים לבקבוקון זכוכית של 20 מ”ל. מדידת 10 מ”ל של 1,4-דיוקסן והעברה לבקבוקון הזכוכית באמצעות פיפטה מזכוכית. הוסיפו מוט ערבוב מגנטי קטן לבקבוקון הזכוכית.אזהרה: 1,4-דיוקסן הוא ממס אורגני מסוכן. השתמשו בציוד בטיחות אישי מתאים ועבדו בתוך מכסה אדים. מניחים את בקבוקון הזכוכית בתוך אמבט מים חמים המחומם ל-70 מעלות צלזיוס ומערבבים את התכולה למשך הלילה עד שכל הפולימרים מתמוססים במלואם. אחסנו את התמיסה במיכל זכוכית אטום עד לשימוש. מלאו את תבניות ה-BVOH בתמיסת PLLA:PLGA. באמצעות פיפטה תזוזה חיובית, למדוד 30 μL של תמיסת הפולימר ולמלא את התבנית.הערה: הנפח הדרוש למילוי התבנית ישתנה בהתאם לנפח הכלי המתוכנן. יש להמשיך להוסיף את תמיסת הפולימר עד שהמשפך של התבנית יתמלא במלואו. צנטריפוגה את התבנית ב 100 × גרם במשך 2 דקות. מלאו את התבנית ב-20 μL נוספים של תמיסת הפולימר כדי להבטיח מילוי מלא. הקפא את התבניות המלאות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח שכל תמיסת הפולימרים תקפא. הסר את הממס מן התבניות על ידי lyophilizing אותם לילה.הערה: צבע הפולימר בתבנית צריך להפוך משחיר ללבן לאחר תהליך ייבוש ההקפאה. כדי להסיר את חומר התבנית המקריב, העבירו את התבניות לאחר תהליך הייבוש בהקפאה לאמבטיית מים שעברה דה-יוניזציה של 5 ליטר תחת ערבוב עדין. החליפו את המים באמבטיה כשהם מתעננים. כאשר כל ה-BVOH מתמוסס, מייבשים את הפיגומים באוויר ומאחסנים אותם בתא ואקום עד לשימוש. 2. ציפוי פיגום כלי הדם בפיברונקטין יש לחטא את פיגומי כלי הדם PLLA:PLGA על ידי טבילתם ב-70% אתנול למשך 30 דקות. לשטוף את הפיגומים 3x 5 דקות עם PBS. הכינו דילול של 50 מיקרוגרם/מ”ל פיברונקטין אנושי ב-PBS וציפו את הפיגומים. יש לערבב 500 μL של תמיסת פיברונקטין (1 מ”ג/מ”ל) עם 9.5 מ”ל של PBS. טבלו את פיגומי כלי הדם המחוטאים בתמיסת פיברונקטין זו ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות כדי לאפשר ספיגת חלבונים. לאחר הדגירה, לשטוף את הפיגומים עם PBS כדי להסיר את fibronectin unbound. אחסן את הפיגומים המצופים האלה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. 3. הכנת ביואינק rhCollMA הכינו מאגר פוספטים לנטרול מלאי הביואינק החומצי rhCollMA. הכינו מלאי של פי 10 של מאגר פוספטים על ידי המסת 5.495 גרם של Na2HPO4, 1.55 גרם של NaH2PO4, ו-30 מ”ג של NaCl ב-50 מ”ל של מים שעברו דה-יוניזציה. הכינו דילול של פי 10 ממאגר הפוספטים המלאי פי 10 על ידי שילוב של חלק אחד של חיץ פוספט פי 10 עם 9 חלקים של מים שעברו דה-יוניזציה. שלב 900 μL של תמיסת rhCollMA במלאי עם 100 μL של חיץ פוספט 10x כדי לנטרל את תמיסת rhCollMA החומצית. דיללו את תמיסת ה-rhCollMA המנוטרלת לריכוז הרצוי של 10 מ”ג/מ”ל על ידי ערבובה עם הכמות הנדרשת של מאגר פוספט אחד.הערה: ריכוז המניות של rhCollMA משתנה בין מגרשים. לכן, נפח של 1x 1x 1 כרית פוספט הדרוש כדי להגיע לריכוז הרצוי ישתנה. הכן את תמיסת הפורוגן-פוטו-יניטיטור (PEO-LAP) כך שתשולב עם ה-rhCollMA הנייטרלי המדולל. הכן תמיסה של 1.6% (w/v) של פולי(אתילן אוקסיד) (PEO) ב- DMEM ללא פנול ללא אדום על ידי המסת 160 מ”ג של PEO ב-10 מ”ל של DMEM. הוסף 20 מ”ג של ליתיום פניל-2,4,6-טרימתילבנזוילפוספינאט (LAP) לתמיסה זו כדי לקבל 0.2% (w/v) LAP בתמיסה. מנקודה זו, לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום או לשמור אותו במקום חשוך כדי להגן עליו מפני אור. לעקר את תמיסת PEO-LAP על ידי העברתו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. אחסן פתרון זה בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) למשך שבוע אחד עד שבוע. לפני ההדפסה הביולוגית, ערבבו את תמיסת ה-rhCollMA הנייטרלית המדוללת עם תמיסת PEO-LAP ביחס של 1:1 כדי לקבל את פתרון הביו-אינק הסופי. השתמשו בצנרת, ולא במערבולת, כדי לערבב את התמיסות תוך הימנעות מבועות אוויר. אם הרבה בועות מוכנסות לפתרון, צנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 30 שניות. לאחר צנטריפוגה, ערבבו שוב את תמיסת הביו-אינק כדי להבטיח הומוגניות. 4. הכנת אמבטיית תמיכה גרעינית מכינים חומר תמיכה גרגירי ג’לטין. בארון בטיחות ביולוגי, מחלקים את התכולה של צינור אחד של 2 גרם של חומר תמיכה ליופילי לשני צינורות חרוטיים סטריליים של 50 מ”ל, שכל אחד מהם מכיל כ-1 גרם. הוסיפו 40 מ”ל של DMEM נטול פנול-אדום קר (4 מעלות צלזיוס) לכל צינור, והתפתלו במרץ עד שכל חומר התמיכה הלופילי מתמוסס. תן ל- slurry שנוצר לשבת על 4 ° C כדי לאפשר לחומר התומך להתייבש מחדש. דגה את חומר התמיכה בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להפחית בועות. צנטריפוגה את חומר התמיכה ב 2,000 × g במשך 5 דקות. ודא שהחומר נמצא בתחתית הצינור והסופרנט ברור. לשאוף את supernatant, תוך הקפדה לא לשאוף את חומר התמיכה בתחתית.הערה: החומר התומך לא צריך לזרום בעת הטיית הצינור לאחר הסרת הסופרנאטנט. אם החומר זורם, צנטריפוגה שוב באמצעות אותן הגדרות אך מבלי להוסיף סופרנטנט חדש. מעבירים כ-4 מ”ל של חומר התמיכה המוכן והדחוס לכל באר של צלחת בעלת 12 בארות באמצעות פיפטת תזוזה חיובית. הקש על צלחת הבאר על משטח קשה כדי לאלץ את חומר התמיכה להתפשט באופן שווה בבאר.הערה: הנפח המינימלי המומלץ של חומר התמיכה הוא פי 3 מנפח המבנה שיודפס בו. מניחים את צלחת הבאר עם חומר התמיכה על במת ביו-פרינטר מקורר, או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, עד לשימוש בה כדי למנוע מהחלקיקים הג’לטיניים להתמוסס. 5. שילוב תאי אנדותל ותאי תמיכה עם הביו-אינק יש להכין את מדיום תאי האנדותל בהתאם להוראות היצרן על ידי ערבוב המדיום הבסיסי עם רכיב הקיט הבינוני המתאים לו, כולל תמיסה אנטיביוטית, סרום בקר עוברי ותוספי גדילת תאי אנדותל. הכינו את מדיום תאי הגזע של עיסת השיניים על ידי שילוב של 500 מ”ל של DMEM דל גלוקוז, 58 מ”ל של סרום בקר עוברי, 5.8 מ”ל של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 5.8 מ”ל של תחליף גלוטמין, 5.8 מ”ל של 1 M HEPES ו-5.8 מ”ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין. הכינו תרחיף המכיל 2 × 106 תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי (HAMEC-ZsGreen1) ו-6 × 106 תאי גזע של עיסת שיניים (DPSCs) ב-10 מ”ל של מדיום תאי אנדותל. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-200 × גרם למשך 4 דקות כדי לקבל כדור תא. לשאוף לתווך העל-טבעי. בצעו שימוש חוזר בכדור התא ב-1 מ”ל של ביואינק rhCollMA שהוכן בעבר (המכיל PEO-LAP) כדי להשיג ביואינק עם ריכוז תאים כולל של 8 × 106 תאים לכל 1 מ”ל של ביואינק.אזהרה: לאחר שילוב הביואינק עם התאים, המשך מיד לשלב הבא. אם התאים יישארו בתרחיף במשך זמן רב, התאים ישקעו לתחתית הצינור, וכדאיותם תידרדר. לניסויים שאינם מערבים תאים, יש לדלג על שלבים 5.1-5.5, או לשלב חרוזים פלואורסצנטיים עם הביואינק במקום תאים להדמיה מיקרוסקופית משופרת של המבנים המודפסים. מעבירים את תערובת התאים-ביו-אינק למחסניות הדפסה. התאם מחט בקוטר פנימי של 0.22 מ”מ למחסנית הדפסת ענבר של 3 מ”ל והנח את המחסנית בצינור חרוטי של 50 מ”ל. העבר 1 מ”ל של תערובת התאים-ביואינק למחסנית ההדפסה על ידי מילויה מלמעלה, באמצעות פיפטת תזוזה חיובית להפחתת בועות. התקן את מחסנית ההדפסה בכלי המתאים בביו-פרינטר. 6. הדפסה ביולוגית של רשתות מיקרו-וסקולריות באמצעות ביו-אינק rhCollMA צור תכנון CAD תלת-ממדי עבור הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית. שרטטו תבנית דו-ממדית של ריבוע 4 מ”מ המכיל במרכזו תעלה מעגלית בקוטר 2 מ”מ. הוציאו את הסקיצה ב-4 מ”מ כדי לקבל קוביית 4 מ”מ x 4 מ”מ x 4 מ”מ עם ערוץ מרכזי. ייצא אובייקט זה כאובייקט . קובץ STL. ייבאו צלחת של 12 בארות. תבנית STL לתוך לשונית המידול המוצק בתוכנת החיתוך של הביו-פרינטר וממקמת אותה באזור המיועד של מיטת ההדפסה הווירטואלית. ייבא את . קובץ STL של צורת הקובייה לתוך לשונית המידול המוצק בתוכנת החיתוך של bioprinter. לחץ על תיבת הסימון השתמש בחותך חיצוני | קביעת תצורה של slicer תחת המקטע מאפייני אובייקט . בחלון הקופץ, בחר תבנית rectilinear עבור תבנית המילוי והקלד 30% בצפיפות המילוי. לחץ על קבל. הניחו עותק של צורת הקובייה בכל באר וירטואלית רצויה על ידי לחיצה על הקובייה והזזתה באמצעות העכבר. צור הגדרות חומר חדשות עבור rhCollMA bioink בכרטיסיית החומרים של תוכנת חיתוך הביו-פרינטר על-ידי לחיצה על לחצן הוסף חומר . בחר את הגדרות החומר להדפסה. עבור לחץ, סוג 2 psi בתיבה המתאימה. עבור מהירות, הקלד 20 מ”מ לשנייה בתיבה המתאימה.הערה: לכל חומר ביואינק יש הגדרות הדפסה שונות משלו שניתן לשמור ברשימת החומרים ביישום. הקצה את ערכי רוחב השורה וגובה הקו ל- 0.24 מ”מ ואת ערך ההאצה ל- 400 מ”מ לשנייה2, על-ידי הקלדת ערכים אלה בתיבות המתאימות. בכרטיסייה מידול מוצק , לחץ על אובייקט הקובייה ולאחר מכן לחץ על חומר rhCollMA ממקטע החומרים כדי להקצות אותו לצורת הקובייה. בכרטיסייה bioassembly , לחץ על לחצן שלח משימת הדפסה כדי לשלוח את משימת ההדפסה לפרינטר הביולוגי. טען את מחסנית ההדפסה העמוסה בביו-אינק התאי לכלי ההפצה הפנאומטי הסביבתי 3 מ”ל של הביו-פרינט מבוסס האקסטרוזיה התלת-ממדית. הגדר את טמפרטורת מיטת ההדפסה ל- 4 °C (74 °F) על-ידי לחיצה על הכפתור הקריר מתחת לכרטיסייה Control-חימום/קירור במסך ממשק bioprinter. טען את הצלחת עם אמבט התמיכה על מיטת המדפסת.הערה: ההגדרות של החומר עבור לחץ הדפסה ומהירות עשויות להשתנות עקב הבדלים בטמפרטורת הסביבה או בהשתנות אצווה ביו-אינק. לדוגמה, בימים קרים יותר, יש צורך בלחץ גבוה יותר או במהירות איטית יותר כדי להוציא את אותה כמות של חומר. בכרטיסיית ההדפסה במסך ממשק הביו-פרינטר, לחץ על משימת ההדפסה שנשלחה בשלב 6.7. ולחץ על התחל | עבור כדי להתחיל את עבודת ההדפסה. לאחר ההדפסה, חשוף את לוח הבאר למקור אור של 405 ננומטר בעוצמה של 3 mW/cm2 במשך 30 שניות כדי ליזום את הקישור ההצלבה של הביו-אינק rhCollMA. לאחר קישור צולב, דגירה של צלחת הבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 20 דקות לפחות עד שכל אמבט התמיכה נמס. לשאוף בעדינות את אמבט התמיכה החריף ולהחליף אותו עם מדיום תאי אנדותל. דגירה של המבנים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד לשימוש בשלבים נוספים.הערה: בשל התכווצות המבנה לאחר ההדפסה, מומלץ לבצע את ההרכבה שלב 7 באותו יום כמו שלב 6. 7. הרכבת הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית עם פיגום כלי הדם כדי לקבל את הדש הווסקולרי המהונדס מיד לאחר הסרת חומר התמיכה של הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית, הניחו פיגום כלי דם PLLA:PLGA מצופה פיברונקטין בערוץ הראשי של המבנה המודפס ביולוגית. דגירה של המבנים המורכבים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך יומיים. מרפדים את הלומן של פיגום כלי הדם בתאי אנדותל. הכינו תרחיף תאי של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי (HAMEC-tdTomato) המבטאים tdTomato בריכוז של 1 × 107 תאים/מ”ל. מניחים טיפה של 20 μL של תרחיף תא זה על משטח הידרופובי (כלומר, צלחת שאינה תרבית רקמה [nonTC] בקוטר 10 ס”מ). מניחים בעדינות את פיגומי כלי הדם על גבי הטיפה, כך שהלומן של הפיגום בקצה אחד יוצר מגע עם טיפת התא. שאפו את הטיפה מהקצה הנגדי של הפיגום (כלומר, הקצה שאינו בא במגע עם הטיפה), ומלאו את לומן שלה בתרחיף התא. מניחים את הפיגום הזורע בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומכניסים אותו לרוטציה בפנים באינקובטור לח למשך 60 דקות. לאחר מכן, מעבירים את הפיגום לצלחת של 12 בארות ומוסיפים 2 מ”ל של מדיום תאי אנדותל. תרבית את הדשים המהונדסים במשך 7 ימים, תוך החלפת המדיום כל יומיים במדיום תאי אנדותל טריים. 8. מיקרוסקופיה קונפוקלית וכתם אימונופלואורסצנטי של הדשים המהונדסים לאחר 4 ימים ו-7 ימים של תרבית, בצע הדמיה של תאים חיים של הפיגומים המורכבים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. הגדר את תעלות הפלואורסצנציה עבור חלבונים פלואורסצנטיים ZsGreen1 ו- tdTomato בתוכנת רכישת התמונה של מיקרוסקופ. בחרו בעדשה אובייקטיבית של 5x/0.16 עם זום של 0.5x (גודל פיקסל 5 מיקרומטר), והגדירו ערימת Z עם 22 פרוסות בעובי של 41 מיקרומטר כל אחת. הגדר סריקת אריחים בגודל 3 x 2 כדי לצלם וללכוד את המבנה כולו. התאם את עוצמת הלייזר וצבר ערכים כדי לקבל אות פלואורסצנטי ברור ללא רוויה ורקע מינימלי ולרכוש את התמונות. בצע הקרנה בעוצמה מרבית של מחסנית Z שנרכשה כדי להשיג תמונה דו-ממדית אחת באמצעות תוכנת רכישת התמונה במיקרוסקופ או בתוכנת ניתוח תמונות דומה. בצע הדמיית הגדלה גבוהה יותר של אזור עניין. עבור לעדשת מטרה של 10x/0.3 עם זום של 0.5 (גודל פיקסל 1.25 μm) והגדר ערימת Z בעובי של 9 פרוסות של 41 מיקרומטר. בצע שלבים 8.2.-8.3. לאחר 7 ימים של תרבות, לתקן את הדשים המהונדסים על ידי טבילתם ב 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות. לשטוף את המבנים 3x 5 דקות עם PBS. הוסף 0.3% (v/v) Triton-X ב- PBS למבנים ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל לתאים. לשטוף את המבנים 3x 5 דקות עם PBS. הכינו תמיסת חסימה על ידי המסת 5% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS. הוסיפו את תמיסת החסימה לדשים המהונדסים ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הכן את תמיסת הנוגדן העיקרית על ידי דילול של נוגדן אקטין שריר אנטי-חלק (anti-SMA) של עכבר 1:50 בתמיסת BSA של 5% שהוכנה בעבר כדי להכתים את תאי התמיכה המבטאים SMA. דגירה של הפיגומים בתמיסת הנוגדנים העיקרית בן לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3x 5 דקות עם PBS. הכן את תמיסת הנוגדן המשני על ידי דילול נוגדן IgG 1:400 של עז מצומדת Cy3 ונוגדן 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI, 2.5 מיקרוגרם/מ”ל) ב-PBS. יש למרוח את תמיסת הנוגדנים המשנית על הפיגומים ולדגום במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף 3x 5 דקות עם PBS. אחסן את המבנים בטמפרטורה של 4 °C ב- PBS למשך עד חודש אחד. דמיינו את הפיגומים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר. הגדר את שלושת הערוצים הפלואורסצנטיים (DAPI, ZsGreen ו- Cy3) בתוכנת רכישת התמונות של המיקרוסקופ. הגדר ערימת Z עם עובי מקטע של 2 מיקרומטר המשתרע על פני עובי כולל של 50 מיקרומטר. לאחר מכן, הגדר סריקת אריחים כדי לצלם אזורים גדולים יותר של המבנה. התאם את פרמטרי הרכישה כדי לקבל אות פלואורסצנטי ברור ללא רוויה ורקע מינימלי. קבל את התמונות באמצעות המטרה 20x/0.8 עם זום של 1.0x (גודל פיקסל 0.31 מיקרומטר). בצע הקרנה בעוצמה מרבית של מחסנית Z שנרכשה כדי להשיג תמונה דו-ממדית אחת באמצעות תוכנת רכישת התמונה במיקרוסקופ או בתוכנת ניתוח תמונות דומה. 9. אנסטומוס הדש המהונדס ישירות לעורק הירך של חולדה באמצעות טכניקת חפתים מכינים ומעקרים (אוטוקלאב) את הכלים הכירורגיים הבאים: אזמל מס’ 15, זוג מלקחיים בעלי שיניים עדינות וזוג קטן של מספריים עם טיפול בטבעת. בנוסף, הכינו ועקרו את הכלים המיקרו-כירורגיים הבאים: מלקחיים ישרים ומחודדים מס’ 3 של תכשיטן מס’, מלקחיים של תכשיטן זוויתי, מחזיק מחט בעל ידית עגולה עם לסתות מעוקלות, זוג מרחיבי כלי, מספריים מנתחים, מספריים אדוונטיטיים, וכן מהדקי כלי עם המוליך שלהם. הכינו תמיסה של 100 IU/mL מלוחים הפריניים על ידי דילול 5 מ”ל של תמיסת הפרין במלאי עם 195 מ”ל של מי מלח. חותכים ומעקרים את אזיקי הפולימיד. חותכים מקטעים של 2.5 מ”מ של שפופרת פולימיד מתחת למיקרוסקופ ניתוח. בקצה אחד של כל חתך, בצע חתך באורך 1.25 מ”מ בקיר הצינור כדי לקבל ידית חפתים. בצע חיתוך זוויתי בקצה השני של הצינור כדי להקל על תפיחת כלי השיט. הטביעו את האזיקים ב-70% אתנול ולאחר מכן שתי שטיפות עם מי מלח הפריניים. הכינו חולדה ספראג-דאולי זכרית (275-350 גרם) לניתוח. שבעה ימים לפני הניתוח, התחילו לתת מינון יומי תת עורי של ציקלוספורין (10 מ”ג ק”ג-1) כדי להשיג דיכוי חיסוני. לפני הניתוח, מרדימים את החיה באמצעות שאיפת איזופלורן של 3% על פי SOP מוסדי באמצעות תא אינדוקציה. אמתו הרדמה עמוקה על ידי צביטה בשתי כפות הרגליים ובדיקת רפלקסים. מתן מינון תת עורי של בופרנורפין משכך כאבים (0.03 מ”ג ק”ג-1) והפרין נוגד קרישה (200 יחב”ל ק”ג-1). יש למרוח משחת סיכה לעיניים על עיני החיה כדי למנוע התייבשות. לגלח את האזור הכירורגי של החולדה ולחטא את האתר עם יוד ולאחר מכן 70% אתנול. הצמידו את גפי החיה לשולחן באמצעות סרט דבק. לחשוף ולבודד את עורק הירך המשותף. בצע חתך אלכסוני באורך 2 ס”מ דרך העור, לאורך הקעורה בין הרגל לבטן. באמצעות מלקחיים ומספריים בעלי קצה קהה, שחררו את העור מהרקמה שמתחת כדי לדמיין את כרית השומן המפשעתית. באמצעות מספריים ומלקחיים, חותכים ישר דרך כרית השומן סביב השוליים העליונים, המדיאליים והתחתונים. שימו לב לא לחתוך כלים גדולים מתחת למשטח השומן. לשקף את כרית השומן לרוחב, משאיר את כלי העיכול epigastric שלם. מניחים גזה רטובה על כרית השומן המוחזרת כדי למנוע ייבוש ולקבע אותה במקומה. ודא שכלי הירך הנפוצים גלויים לעין.הערה: כרית השומן תשמש מאוחר יותר להפעלת לחץ רך על האנסטומוזות. חשוף את עורק הירך מהרצועה המפשעתית באופן פרוקסימלי לנקודת ההסתעפות של העורק האפיגסטרי באופן דיסטלי על ידי חילוץו מהנדן שלו.אזהרה: בדרך כלל יש ענף של עורק הירך העובר מתחתיו, המכונה בדרך כלל הענף של מרפי. שימו לב לא לפגוע בענף הקשה הזה. מחלקים את הענף של מרפי על ידי קשירתו, ולאחר מכן מפרידים את עורק הירך עם שתי ליגטורות במרכז העורק במרווח של 1 מ”מ זו מזו. יש לשמור על קצה אחד של תפר הליגטורה זמן רב כדי להשתמש בו מאוחר יותר כדי למשוך את קצה הכלי דרך השרוול. חותכים את העורק בין שתי הליגטורות באמצעות מספריים של אדוונטיטיה.אזהרה: לא צריך להיות כל דימום בעת ביצוע חתך זה. אם קצה העורק מדמם, הידקו את העורק והחלו מחדש ליגטורה. באמצעות הקצה הארוך של תפר הליגטורה, יש להכניס כל קצה כלי לתוך שרוול פולימיד, כפי שהוכן בשלב הקודם, כך שידיות שני האזיקים מצביעות זו על זו. לאחר ההחדרה, יש למרוח מהדק בו-זמנית על ידית השרוול ועל הכלי, תוך אבטחת השרוול במקום. מכינים תמיסת מלח הפרינית במזרק המצויד במחט 27 גרם. משכו את קצה הכלי הקשור וחתכו אותו קרוב לליגטורה. מיד לשטוף את הכלי מסתיים ביסודיות עם מלוחים heparinized עד לא נראה דם בלומן.אזהרה: יש לוודא כי קצה כלי הדם נשטף היטב מכיוון שכל דם שיישאר בפנים ייצור קריש דם, אשר יוכנס לזרם הדם עם השלמת ההליך. זה עלול להוביל לחסימה של כלי השיט ולאובדן זלוף ברגל. הרחב את לומן הכלי על ידי החזקתו בנדן שלו ביד אחת והרחבת לומן שלו עם מרחיב הכלי ביד השנייה. מניחים תפר היקפי פוליפרופילן 6-0 רופף סביב גוף השרוול. אוורט את קצה הכלי באמצעות שני מרחיבים כלי על גוף השרוול ומהדק אותו במקומו על ידי הידוק התפר ההיקפי.הערה: אם דם כלשהו דולף דרך כלי הדם המהודק במהלך המניפולציות, שטפו את הלומן ביסודיות עם מלח הפריניזציה. יש לשטוף את הדש המהונדס במי מלח, ולאחר מכן להחדיר את השרוול המרופד בכלי לתוך לומן של פיגום כלי הדם. תקן את הפיגום במקומו על ידי הנחת תפר פוליפרופילן 6-0 היקפי סביב הפיגום וגוף השרוול. בצע שלב זה עבור שני צידי פיגום כלי הדם. עוטפים מסנן קרום פוליסטירן של 0.2 מיקרומטר סביב אתר האנסטומוזות כדי לבודד את הדש המהונדס מהרקמה הסובבת. שחררו תחילה את המהדק הדיסטלי; לאחר מכן, שחררו את המהדק הפרוקסימלי כדי להקים מחדש את זרימת הדם דרך כלי הדם. כדי לעצור כל דימום דרך האנסטומוזות, יש לשקף את כרית השומן בחזרה מעל כלי הירך ולהפעיל לחץ עדין באמצעות גזה סטרילית למשך 3 דקות. לתפור את כרית השומן בחזרה למקומה באמצעות פוליפרופילן 6-0; לאחר מכן, לתפור את העור באמצעות 5-0 תפרים נספגים PGA. מנקים את אזור הפצע עם מי מלח ומורחים תמיסת יוד. לכאבים לאחר הניתוח ולניהול בעלי חיים, הכינו 0.1% (v/v) של טרמדול במי השתייה. יתר על כן, לתת מינון יומי של הפרין (200 IU ק”ג-1) ו cyclosporine (10 מ”ג ק”ג-1). מניחים את החיה בכלוב נקי בפני עצמו ומונחים מתחת למנורת חימום. ממשיכים לעקוב אחר החיה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה.