Fabrication de volets vasculaires artificiels à l’aide de technologies d’impression 3D

Toutes les procédures animales ont été approuvées et menées sous la supervision de l’Autorité de recherche préclinique du Technion (PCRA Technion, approbation éthique n° 058-05-20). Des rats Sprague-Dawley mâles (275-350 g) ont été utilisés pour ces études. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole. 1. Fabrication d’échafaudages vasculaires Créez un modèle informatique 3D de la forme d’échafaudage vasculaire souhaitée à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) ou téléchargez un fichier 3D d’une structure vasculaire souhaitée à partir de référentiels en ligne. Créez un cylindre d’un diamètre intérieur de 0,9 mm, d’un diamètre extérieur de 2 mm et d’une hauteur de 18 mm. Ajouter des fenestrations radiales d’un diamètre de 0,22 mm le long de la paroi du cylindre. Créez un moule pour l’échafaudage à l’aide du logiciel de conception 3D et exportez-le en tant que fichier . STL. Ensuite, ajoutez un entonnoir à la conception pour faciliter le remplissage du moule plus tard. Importez le fichier . STL dans le logiciel de découpage pour l’imprimante 3D de modélisation par dépôt fondu (FDM). Découpez le modèle avec une hauteur de calque de 0,1 mm et exportez-le au format .gcode ou envoyez-le directement à l’imprimante 3D. Imprimez le moule en 3D sur une imprimante 3D FDM équipée d’une buse de 0,25 mm, en utilisant un filament de copolymère d’alcool vinylique (BVOH) soluble dans l’eau. Conservez les moules imprimés dans une chambre à vide jusqu’à utilisation.ATTENTION : Évitez de manipuler le filament BVOH à mains nues car il est sensible à l’humidité. De plus, il est recommandé de stocker le filament dans une chambre à vide pour éviter toute exposition à l’humidité. Préparer une solution polymère d’un mélange 1:1 d’acide poly-L-lactique (PLLA) et d’acide polylactique-co-glycolique (PLGA) dans du 1,4-dioxane. Peser 350 mg de PLLA et 350 mg de PLGA et transférer dans un flacon en verre de 20 mL. Mesurer 10 mL de 1,4-dioxane et transférer dans le flacon en verre à l’aide d’une pipette en verre. Ajouter une petite barre d’agitation magnétique au flacon en verre.ATTENTION : Le 1,4-dioxane est un solvant organique dangereux. Utilisez l’équipement de sécurité personnelle approprié et travaillez à l’intérieur d’une hotte. Placez le flacon en verre à l’intérieur d’un bain d’eau chaude chauffé à 70 °C et mélangez le contenu pendant la nuit jusqu’à ce que tous les polymères se dissolvent complètement. Conservez la solution dans un récipient en verre hermétique jusqu’à son utilisation. Remplissez les moules BVOH avec la solution PLLA:PLGA. À l’aide d’une pipette volumétrique, mesurez 30 μL de la solution de polymère et remplissez le moule.REMARQUE: Le volume nécessaire pour remplir le moule changera en fonction du volume du récipient conçu. Continuez à ajouter la solution de polymère jusqu’à ce que l’entonnoir du moule soit entièrement rempli. Centrifuger le moule à 100 × g pendant 2 min. Complétez le moule avec 20 μL supplémentaires de la solution de polymère pour assurer un remplissage complet. Congelez les moules remplis à -80 °C pendant au moins 30 min pour vous assurer que toute la solution de polymère gèle. Retirez le solvant des moules en les lyophilisant pendant la nuit.REMARQUE: La couleur du polymère dans le moule doit passer de claire à blanche après le processus de lyophilisation. Pour enlever le matériau de moule sacrificiel, transférez les moules après le processus de lyophilisation dans un bain-marie désionisé de 5 L sous agitation douce. Remplacez l’eau dans le bain lorsqu’il fait nuageux. Lorsque tout le BVOH se dissout, séchez les échafaudages à l’air libre et stockez-les dans une chambre à vide jusqu’à utilisation. 2. Revêtement de l’échafaudage vasculaire avec de la fibronectine Désinfectez les échafaudages vasculaires PLLA:PLGA en les immergeant dans de l’éthanol à 70% pendant 30 min. Lavez les échafaudages 3x 5 min avec PBS. Préparer une dilution de 50 μg/mL de fibronectine humaine dans du PBS et recouvrir les échafaudages. Mélanger 500 μL de solution mère de fibronectine (1 mg/mL) avec 9,5 mL de PBS. Immerger les échafaudages vasculaires désinfectés dans cette solution de fibronectine et les incuber à 37 °C pendant 60 min pour permettre l’adsorption des protéines. Après l’incubation, rincez les échafaudages avec du PBS pour enlever la fibronectine non liée. Conservez ces échafaudages revêtus à 4 °C jusqu’à 1 semaine. 3. Préparation de bioencre rhCollMA Préparez un tampon phosphate pour neutraliser le stock acide rhCollMA bioink. Préparer un stock 10x de tampon phosphate en dissolvant 5,495 g de Na2HPO4, 1,55 g de NaH2PO4 et 30 mg de NaCl dans 50 mL d’eau désionisée. Préparer une dilution 10 fois du tampon phosphate 10x stock en combinant 1 partie du tampon phosphate 10x avec 9 parties d’eau désionisée. Mélanger 900 μL de solution rhCollMA mère avec 100 μL de tampon phosphate 10x pour neutraliser la solution acide de rhCollMA. Diluer la solution de rhCollMA neutralisée à la concentration souhaitée de 10 mg/mL en la mélangeant avec la quantité requise de tampon phosphate 1x.REMARQUE: La concentration en stock de rhCollMA varie d’un lot à l’autre. Par conséquent, le volume de tampon phosphate 1x nécessaire pour atteindre la concentration souhaitée variera. Préparer la solution porogène-photoinitiateur (PEO-LAP) à combiner avec le rhCollMA neutre dilué. Préparer une solution à 1,6 % (p/v) de poly(oxyde d’éthylène) (PEO) dans du DMEM sans phénol en dissolvant 160 mg de PEO dans 10 mL de DMEM. Ajouter 20 mg de lithium phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP) à cette solution pour obtenir 0,2 % (p/v) de LAP dans la solution. À partir de ce moment, couvrez la solution avec du papier d’aluminium ou conservez-la dans un endroit sombre pour la protéger de la lumière. Stériliser la solution PEO-LAP en la faisant passer à travers un filtre de 0,22 μm. Conserver cette solution à 4 °C jusqu’à 1 semaine. Avant la bioimpression, mélanger la solution neutre diluée de rhCollMA avec la solution PEO-LAP dans un rapport de 1:1 pour obtenir la solution bioencre finale. Utilisez le pipetage, plutôt qu’un vortex, pour mélanger les solutions tout en évitant les bulles d’air. Si beaucoup de bulles sont introduites dans la solution, centrifugez-la à 2 000 × g pendant 30 s. Après centrifugation, mélanger à nouveau la solution bioink pour assurer l’homogénéité. 4. Préparation granulaire du bain de soutien Préparez un matériau de support granulaire en gélatine. Dans une armoire de sécurité biologique, diviser le contenu d’un tube de 2 g de matériau de support lyophilisé en deux tubes coniques stériles de 50 mL, contenant chacun environ 1 g. Ajouter 40 mL de DMEM froid (4 °C) sans phénol dans chaque tube et vortex vigoureusement jusqu’à ce que tout le matériau de support lyophilisé se dissout. Laisser reposer la boue résultante à 4 °C pour permettre au matériau de support de se réhydrater. Dégazez le matériau de support dans une chambre à vide pendant 30 minutes pour réduire les bulles. Centrifuger le matériau de support à 2 000 × g pendant 5 min. Assurez-vous que le matériau se trouve au fond du tube et que le surnageant est clair. Aspirez le surnageant, tout en veillant à ne pas aspirer le matériau de support en bas.REMARQUE: Le matériau de support ne doit pas s’écouler en inclinant le tube après avoir retiré le surnageant. Si le matériau s’écoule, centrifugez-le à nouveau en utilisant les mêmes réglages, mais sans ajouter de nouveau surnageant. Transférer environ 4 mL du matériau de support préparé et compacté dans chaque puits d’une plaque de 12 puits à l’aide d’une pipette à déplacement positif. Tapotez la plaque du puits sur une surface dure pour forcer le matériau de support à se répandre uniformément dans le puits.REMARQUE: Le volume minimal recommandé de matériel de support est de 3 fois le volume de la construction qui y sera imprimée. Placez la plaque de puits avec le matériau de support sur une étape de bio-imprimante refroidie, ou à 4 °C, jusqu’à son utilisation pour empêcher les particules de gélatine de fondre. 5. Incorporation de cellules endothéliales et de cellules de soutien avec la bioencre Préparez le milieu cellulaire endothélial conformément aux instructions du fabricant en mélangeant le milieu basal avec son composant de kit de milieu correspondant, y compris une solution antibiotique, du sérum bovin fœtal et des suppléments de croissance cellulaire endothéliale. Préparer un milieu de cellules souches de la pulpe dentaire en combinant 500 mL de DMEM à faible teneur en glucose, 58 mL de sérum bovin fœtal, 5,8 mL d’acides aminés non essentiels (NEAA), 5,8 mL de substitut de glutamine, 5,8 mL de 1 M HEPES et 5,8 mL de solution de pénicilline-streptomycine-nystatine. Préparer une suspension contenant 2 × 10cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires humaines exprimant 6 ZsGreen1 (HAMEC-ZsGreen1) et 6 × 106 cellules souches de la pulpe dentaire (CSPS) dans 10 mL de milieu cellulaire endothélial. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 × g pendant 4 min pour obtenir une pastille de cellule. Aspirer le milieu surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de bioencre rhCollMA préparée précédemment (contenant PEO-LAP) pour obtenir une bioencre avec une concentration cellulaire totale de 8 × 106 cellules pour 1 mL de bioencre.ATTENTION: Après avoir combiné la bioencre avec les cellules, passez immédiatement à l’étape suivante. Si les cellules sont laissées dans la suspension pendant une longue période, les cellules vont couler au fond du tube et leur viabilité va se détériorer. Pour les expériences n’impliquant pas de cellules, sautez les étapes 5.1 à 5.5 ou incorporez des billes fluorescentes avec la bioencre au lieu de cellules pour une visualisation microscopique améliorée des constructions imprimées. Transférer le mélange cellules-bioencre dans des cartouches d’impression. Placez une aiguille de 0,22 mm de diamètre interne sur une cartouche d’impression ambrée de 3 mL et placez la cartouche dans un tube conique de 50 mL. Transférer 1 mL du mélange cellules-bioencre dans la cartouche d’impression en la remplissant par le haut, à l’aide d’une pipette à déplacement positif pour réduire les bulles. Installez la cartouche d’impression dans l’outil approprié au niveau de la bioimprimante. 6. Bio-impression de réseaux microvasculaires à l’aide de rhCollMA bioink Créez une conception CAO 3D pour le réseau microvasculaire bioimprimé. Esquissez un motif 2D d’un carré de 4 mm contenant un canal circulaire de 2 mm de diamètre en son centre. Extruder l’esquisse de 4 mm pour obtenir un cube de 4 mm x 4 mm x 4 mm avec un canal central. Exportez cet objet en tant que fichier . STL. Importez une plaque de 12 puits. Modèle STL dans l’onglet de modélisation solide du logiciel de découpage de la bioimprimante et placez-le dans la zone désignée du lit d’impression virtuel. Importez le fichier . STL de la forme du cube dans l’onglet de modélisation solide du logiciel de découpage de la bioimprimante. Cliquez sur la case à cocher Utiliser le segment externe | configurer le segment sous la section des propriétés de l’objet . Dans la fenêtre contextuelle, choisissez un motif rectiligne pour le motif de remplissage et tapez 30 % dans la densité de remplissage. Cliquez sur Accepter. Placez une copie de la forme du cube dans chaque puits virtuel souhaité en cliquant sur le cube et en le déplaçant à l’aide de la souris. Créez de nouveaux paramètres de matériau pour rhCollMA bioink dans l’onglet Matériaux du logiciel de tranchage de bio-imprimante en cliquant sur le bouton Ajouter un matériau . Choisissez les paramètres d’impression du matériau. Pour la pression, tapez 2 psi dans la boîte correspondante. Pour la vitesse, tapez 20 mm/s dans la case correspondante.REMARQUE: Chaque matériau bioink a ses propres paramètres d’impression différents qui peuvent être enregistrés dans la liste des matériaux de l’application. Attribuez les valeurs de largeur de ligne et de hauteur de ligne à 0,24 mm et la valeur d’accélération à 400 mm/s2, en tapant ces valeurs dans les cases correspondantes. Dans l’onglet Modélisation solide , cliquez sur l’objet cube, puis cliquez sur le matériau rhCollMA dans la section matériaux pour l’affecter à la forme du cube. Dans l’onglet bioassemblage , cliquez sur le bouton Envoyer le travail d’impression pour envoyer le travail d’impression à la bioimprimante. Chargez la cartouche d’impression chargée avec la bioencre cellulaire dans l’outil de distribution pneumatique ambiant de 3 mL de la bioimprimante à base d’extrusion 3D. Réglez la température du lit d’impression à 4 °C en cliquant sur le bouton de refroidissement sous l’onglet Contrôle-Chauffage/Refroidissement de l’écran de l’interface de la bioimprimante. Chargez la plaque avec le bain de support sur le lit de l’imprimante.REMARQUE: Les paramètres du matériau pour la pression et la vitesse d’impression peuvent changer en raison de différences de température ambiante ou de variabilité des lots de bioencres. Par exemple, les jours plus froids, une pression plus élevée ou une vitesse plus lente est nécessaire pour extruder la même quantité de matériau. Dans l’onglet d’impression de l’écran de l’interface de la bioimprimante, cliquez sur le travail d’impression envoyé à l’étape 6.7. et cliquez sur Démarrer | aller pour commencer le travail d’impression. Après l’impression, exposez la plaque du puits à une source lumineuse de 405 nm avec une intensité de 3 mW/cm2 pendant 30 s pour initier la réticulation de la bioencre rhCollMA. Après réticulation, incuber la plaque du puits à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 20 min jusqu’à ce que tout le bain de support fonde. Aspirer doucement le bain de soutien liquéfié et le remplacer par un milieu cellulaire endothélial. Incuber les constructions à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à utilisation dans les étapes suivantes.REMARQUE : En raison de la contraction de la construction après l’impression, il est recommandé d’effectuer l’étape d’assemblage 7 le même jour que l’étape 6. 7. Assemblage du réseau microvasculaire bio-imprimé avec l’échafaudage vasculaire pour obtenir le lambeau vascularisé d’ingénierie Immédiatement après le retrait du matériau de support du réseau microvasculaire bioimprimé, placez un échafaudage vasculaire PLLA:PLGA recouvert de fibronectine dans le canal principal de la structure bioimprimée. Incuber les constructions assemblées à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 2 jours. Tapisser la lumière de l’échafaudage vasculaire avec des cellules endothéliales. Préparer une suspension cellulaire de cellules endothéliales microvasculaires humaines exprimant tdTomato (HAMEC-tdTomato) à une concentration de 1 × 107 cellules/mL. Placez une gouttelette de 20 μL de cette suspension cellulaire sur une surface hydrophobe (c.-à-d. un plat de 10 cm de culture non tissulaire [nonTC]). Placez doucement les échafaudages vasculaires sur le dessus de la gouttelette, de sorte que la lumière de l’échafaudage à une extrémité entre en contact avec la gouttelette cellulaire. Aspirer la gouttelette de l’extrémité opposée de l’échafaudage (c’est-à-dire l’extrémité qui n’entre pas en contact avec la gouttelette), en remplissant sa lumière avec la suspension cellulaire. Placez l’échafaudage ensemencé dans un tube de microcentrifugation et placez-le dans un rotateur à l’intérieur dans un incubateur humidifié pendant 60 min. Ensuite, transférez l’échafaudage dans une plaque de 12 puits et ajoutez 2 mL de milieu cellulaire endothélial. Cultivez les lambeaux artificiels pendant 7 jours, tout en remplaçant le milieu tous les 2 jours par un milieu cellulaire endothélial frais. 8. Microscopie confocale et coloration par immunofluorescence des volets modifiés Après 4 jours et 7 jours de culture, effectuer une imagerie sur cellules vivantes des échafaudages assemblés à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Définissez les canaux de fluorescence pour les protéines fluorescentes ZsGreen1 et tdTomato sur le logiciel d’acquisition d’images au microscope. Choisissez un objectif 5x/0.16 avec zoom 0.5x (taille de pixel 5 μm) et définissez une pile Z avec 22 tranches d’une épaisseur de 41 μm chacune. Définissez une numérisation de tuiles 3 x 2 pour imager et capturer l’ensemble de la construction. Ajustez l’intensité du laser et les valeurs de gain pour obtenir un signal fluorescent clair sans saturation et avec un arrière-plan minimal et acquérir les images. Effectuez une projection d’intensité maximale de la pile Z acquise pour obtenir une seule image 2D à l’aide du logiciel d’acquisition d’images au microscope ou d’un logiciel d’analyse d’images similaire. Effectuez une imagerie à grossissement plus élevé d’une région d’intérêt. Passez à un objectif 10x/0.3 avec zoom 0,5 (taille de pixel 1,25 μm) et définissez une pile Z avec 9 tranches d’épaisseur de 41 μm. Effectuez les étapes 8.2.-8.3. Après 7 jours de culture, fixez les volets artificiels en les immergeant dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min. Lavez les constructions 3x 5 min avec PBS. Ajouter 0,3 % (v/v) de Triton-X en PBS aux constructions et incuber pendant 15 min à température ambiante pour perméabiliser les cellules. Lavez les constructions 3x 5 min avec PBS. Préparer une solution bloquante en dissolvant 5 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS. Ajouter la solution de blocage aux volets techniques et incuber pendant 1 h à température ambiante. Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant l’anticorps anti-actine musculaire lisse (anti-SMA) 1:50 de souris dans la solution de BSA à 5% préparée précédemment pour colorer les cellules de soutien exprimant la SMA. Incuber les échafaudages dans la solution d’anticorps primaire pendant la nuit à 4 °C. Laver 3x 5 min avec PBS. Préparer la solution d’anticorps secondaire en diluant l’anticorps IgG 1:400 de chèvre conjugué à Cy3 et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 2,5 μg/mL) dans du PBS. Appliquer la solution d’anticorps secondaire sur les échafaudages et incuber pendant 3 h à température ambiante. Laver 3x 5 min avec PBS. Stockez les constructions à 4 °C dans PBS jusqu’à 1 mois. Imagez les échafaudages colorés à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Définissez les trois canaux de fluorescence (DAPI, ZsGreen et Cy3) sur le logiciel d’acquisition d’images au microscope. Définissez une pile Z avec une épaisseur de section de 2 μm couvrant une épaisseur totale de 50 μm. Ensuite, définissez une numérisation par vignette pour imager de plus grandes zones de la construction. Ajustez les paramètres d’acquisition pour obtenir un signal fluorescent clair sans saturation et avec un arrière-plan minimal. Acquérir les images à l’aide d’un objectif 20x/0.8 avec zoom 1.0x (taille de pixel 0.31 μm). Effectuez une projection d’intensité maximale de la pile Z acquise pour obtenir une seule image 2D à l’aide du logiciel d’acquisition d’images au microscope ou d’un logiciel d’analyse d’images similaire. 9. Anastomosing du lambeau artificiel directement sur l’artère fémorale d’un rat à l’aide d’une technique de brassard Préparer et stériliser (autoclave) les outils chirurgicaux suivants: scalpel n ° 15, une paire de pinces à dents fines et une petite paire de ciseaux à manche annulaire. En outre, préparez et stérilisez les outils microchirurgicaux suivants: une pince de bijoutier droite et fine n ° 3, une pince de bijoutier inclinée, un porte-aiguille à manche rond avec des mâchoires incurvées, une paire de dilatateurs de vaisseaux, des ciseaux disséquants, des ciseaux adventices, ainsi que des pinces à vaisseau avec leur applicateur. Préparer une solution de solution saline héparinisée de 100 UI/mL en diluant 5 mL de solution mère d’héparine avec 195 mL de solution saline. Couper et stériliser les poignets en polyimide. Couper des sections de 2,5 mm d’un tube de polyimide sous un microscope à dissection. À une extrémité de chaque section, faites une incision longitudinale de 1,25 mm dans la paroi du tube pour obtenir une poignée de brassard. Faites une coupe inclinée à l’autre extrémité du tube pour faciliter l’éversion du vaisseau. Immergez les poignets dans de l’éthanol à 70% suivi de deux lavages avec une solution saline héparinisée. Préparez un rat Sprague-Dawley mâle (275-350 g) pour la chirurgie. Sept jours avant la chirurgie, commencez à administrer une dose quotidienne sous-cutanée de cyclosporine (10 mg kg-1) pour obtenir une immunosuppression. Avant la chirurgie, anesthésier l’animal en utilisant 3% d’isoflurane par inhalation selon la POS institutionnelle à l’aide d’une chambre d’induction. Vérifiez l’anesthésie profonde en pinçant les deux pieds et en vérifiant les réflexes. Administrer une dose sous-cutanée de buprénorphine analgésique (0,03 mg kg-1) et d’héparine anticoagulante (200 UI kg-1). Appliquez une pommade lubrifiante pour les yeux de l’animal pour prévenir la déshydratation. Rasez la zone chirurgicale du rat et désinfectez le site avec de l’iode, puis de l’éthanol à 70%. Fixez les membres de l’animal à la table à l’aide de ruban adhésif. Exposez et isolez l’artère fémorale commune. Faites une incision oblique de 2 cm de long à travers la peau, le long de la concavité entre la jambe et l’abdomen. À l’aide de pinces et de ciseaux émoussés, libérez la peau du tissu sous-jacent pour visualiser le coussinet adipeux inguinal. À l’aide de ciseaux et de pinces, coupez à travers le coussinet de graisse autour des marges supérieures, médiales et inférieures. Faites attention à ne pas couper de gros vaisseaux sous le coussinet de graisse. Réfléchissez le coussinet de graisse latéralement, en laissant les vaisseaux épigastriques intacts. Placez une gaze humide sur le tampon de graisse réfléchi pour éviter le dessèchement et fixez-le en place. Assurez-vous que les vaisseaux fémoraux communs sont visibles.REMARQUE: Le coussinet adipeux sera ensuite utilisé pour appliquer une pression douce sur les anastomoses. Exposez l’artère fémorale du ligament inguinal par voie proximale au point de ramification de l’artère épigastrique distalement en l’extrayant de sa gaine.ATTENTION: Il y a généralement une branche de l’artère fémorale qui court en dessous, communément appelée branche de Murphy. Faites attention à ne pas endommager cette branche difficile à voir. Divisez la branche de Murphy en la ligaturant, puis ligaturez l’artère fémorale avec deux ligatures au milieu de l’artère espacées de 1 mm. Gardez une extrémité de la suture ligature longue pour l’utiliser plus tard pour tirer l’extrémité du vaisseau à travers le brassard. Coupez l’artère entre les deux ligatures à l’aide de ciseaux adventices.ATTENTION: Il ne devrait pas y avoir de saignement lors de l’exécution de cette coupe. Si l’extrémité artérielle saigne, serrez l’artère et réappliquez une ligature. À l’aide de l’extrémité longue de la suture ligature, insérez chaque extrémité du vaisseau dans un brassard en polyimide, tel que préparé à l’étape précédente, de sorte que les poignées des deux poignets pointent l’une vers l’autre. Après l’insertion, appliquez une pince simultanément sur le manche du brassard et le récipient, en fixant le brassard en place. Préparer une solution saline héparinisée dans une seringue équipée d’une aiguille de 27 G. Tirez sur l’extrémité du vaisseau ligaturé et coupez-la près de la ligature. Lavez immédiatement l’extrémité du vaisseau soigneusement avec la solution saline héparinisée jusqu’à ce qu’aucun sang ne soit visible dans la lumière.ATTENTION: Assurez-vous que l’extrémité du vaisseau est bien lavée car tout sang laissé à l’intérieur formera un caillot, qui sera introduit dans la circulation sanguine à la fin de la procédure. Cela pourrait entraîner une occlusion du vaisseau et une perte de perfusion à la jambe. Dilatez la lumière du vaisseau en le tenant par sa gaine d’une main et en dilatant sa lumière avec le dilatateur du vaisseau de l’autre main. Placez une suture circonférentielle en polypropylène 6-0 autour du corps du brassard. Evert l’extrémité du vaisseau à l’aide de deux dilatateurs de vaisseau sur le corps du brassard et fixez-le en place en resserrant la suture circonférentielle.REMARQUE: Si du sang fuit à travers le vaisseau serré pendant les manipulations, lavez soigneusement la lumière avec une solution saline héparinisée. Rincez le rabat d’ingénierie avec une solution saline héparinisée, puis insérez le brassard doublé dans la lumière de l’échafaudage vasculaire. Fixez l’échafaudage en place en plaçant une suture circonférentielle en polypropylène 6-0 autour de l’échafaudage et du corps du brassard. Faites cette étape pour les deux côtés de l’échafaudage vasculaire. Enroulez un filtre à membrane en polystyrène de 0,2 μm autour du site des anastomoses pour isoler le lambeau artificiel du tissu environnant. Relâchez d’abord la pince distale; ensuite, relâchez la pince proximale pour rétablir le flux sanguin à travers le vaisseau. Pour arrêter tout saignement à travers les anastomoses, réfléchissez le coussinet adipeux sur les vaisseaux fémoraux et appliquez une légère pression à l’aide d’une gaze stérile pendant 3 minutes. Suturer le coussinet de graisse en place en utilisant 6-0 polypropylène; ensuite, suturez la peau à l’aide de sutures résorbables 5-0 PGA. Nettoyez la zone de la plaie avec une solution saline et appliquez une solution d’iode. Pour la douleur postopératoire et la prise en charge des animaux, préparer un 0,1% (v / v) de tramadol dans l’eau potable. De plus, administrer une dose quotidienne d’héparine (200 UI kg-1) et de cyclosporine (10 mg kg-1). Placez l’animal dans une cage propre par lui-même placée sous une lampe chauffante. Continuez à surveiller l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne suffisamment conscience pour maintenir la position couchée sternale.