JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Индуцирование спасения полипа в коралловых колониях для получения индивидуализированных микропропагатов для лабораторного экспериментального использования

Published: April 28, 2022
doi:
10.3791/63840
, , ,
1Red Sea Research Center (RSRC), Division of Biological and Environmental Science and Engineering (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Спасение полипа — это процесс, вызванный острым стрессом, при котором коралловые полипы переваривают ткань, соединяющую их с их колонией, и отделяются от нее, чтобы жить как индивидуумы. В настоящем протоколе описывается, как вызвать микроразмножение кораллов путем спасения с использованием гиперсолевых или безкальцевых обработок морской воды.

Abstract

Кораллы — это колониальные животные, образованные модульными единицами, называемыми полипами. Коралловые полипы физиологически связаны и соединены тканью. Феномен спасения полипа — это процесс, вызванный острым стрессом, при котором коралловые полипы переваривают ткань, соединяющую их с остальной частью колонии, и в конечном итоге отделяются от скелета, чтобы продолжать жить как отдельные особи. Коралловые биологи признавали процесс спасения полипа в течение многих лет, но только недавно микрораспространения, генерируемые этим процессом, были признаны модельной системой для исследований биологии кораллов. Использование спасения полипа может создать большое количество клональных единиц из одного фрагмента коралла. Еще одно преимущество заключается в том, что отдельные полипы или участки полипов могут быть легко визуализированы под микроскопом и поддерживаться в высоко стандартизированных недорогих средах, таких как чашки Петри, колбы и микрофлюидные чипы. Настоящий протокол демонстрирует воспроизводимые методы, способные индуцировать микроразмножение кораллов, и различные подходы к поддержанию жизни одиночных полипов в долгосрочной перспективе. Эта методология была способна успешно культивировать полипы коралловых видов Pocillopora verrucosa в течение 8 недель после спасения, демонстрируя практичность использования отдельных коралловых полипов для исследования кораллов.

Introduction

Склерактинские или рифообразующие кораллы являются книдариями, способными образовывать карбонатные скелеты, создавая рифы и структурно сложные экосистемы, которые можно найти от глубокой до мелководной среды1. Тропические коралловые рифы обладают высоким биоразнообразием и обеспечивают основные экосистемные услуги, такие как защита прибрежных районов и поддержание рыболовства2. Большинство мелководных рифообразующих кораллов полагаются на взаимные отношения с водорослями семейства Symbiodiniaceae, которые обеспечивают энергию, необходимую кораллам для построения своих скелетов. Симбиоз между кораллами и водорослями может быть нарушен экологическим стрессом, вызывая обесцвечивание кораллов 3,4,5,6. Недавние температурные аномалии вызвали крупные события обесцвечивания кораллов во всем мире, что привело к массовой гибели кораллов и постоянной деградации рифов 7,8,9,10,11. Поскольку это явление основано на изгнании симбионтов клеточными механизмами, связанными с посттемпературным стрессом, такими как апоптоз, аутофагия и экзоцитоз, обесцвечивание кораллов можно описать как клеточный процесс, который имеет последствия экосистемного масштаба 5,6,12, что означает, что наличие культур коралловых клеток или тканей in vitro было бы применимо для тщательного изучения этого явления.

Из-за важности коралловых рифов и основных угроз, с которыми они сталкиваются, особенно в последние два десятилетия2, кораллы стали центром исследований в целях защиты и восстановления во всем мире13. Тем не менее, разработка подходов и экспериментальных систем, которые являются надежными, воспроизводимыми и предлагают минимальное воздействие на окружающую среду для изучения кораллов, является серьезной борьбой в этой области.

Микроразмножение определяется как пролиферация генотипа организма in vitro путем культивирования его биологического материала в контролируемых сосудах14,15. Культивирование клеток, тканей и органов имеет решающее значение для биологии растений и животных в последние десятилетия. Это позволяет массово воспроизводить организмы в лабораториях, быстро оценивать различные методы лечения (такие как лекарства и фармацевтические препараты) и непосредственно изучать функцию клеток 14,15,16,17. В целом, модели in vitro были полезны для дополнения и углубления исследований различных организмов в лучше контролируемых физических и химических условиях. Благодаря преимуществам методов культивирования in vitro, различные технологии культивирования клеток и тканей животных были разработаны, оптимизированы и использованы в качестве важных инструментов во многих областях исследований, где несколько клеточных линий были изучены и коммерциализированы для многочисленных применений 16,17,18.

Многие достижения в знаниях о клеточной и тканевой культуре были сделаны с момента первой культуры тканей животных в 1882году 17, такие как использование природных и синтетических сред, изобретение установленных клеточных линий и разработка 3D-сред для лучшего культивирования множества типов клеток16,17, 18,19. Тем не менее, область клеточной биологии в основном сосредоточена на избранной группе модельных организмов, в то время как многие таксоны все еще не имеют хорошо зарекомендовавших себя культур in vitro клеток, тканей или органов20. Например, в исследованиях кораллов ни одна увековеченная клеточная линия не была широко использована для исследований, ограничивая исследования коралловых клеток использованием первичных клеточных культур. Эти культуры имеют жизнеспособность, ограниченную несколькими неделями21, без исследований, регистрирующих выживаемость отдельных клеток из всех коралловых тканей в течение более 13 дней до начала 2021года 22. Первый отчет об устойчивых коралловых клеточных линиях, который будет опубликован, был с клетками Acropora tenuis, которые жили до 6 месяцев, и полезность этих клеток для будущих исследований еще предстоит изучить23.

Чтобы преодолеть ограничения в культивировании культур коралловых клеток и поддерживать лабораторную культуру, которая сохраняет общую организацию тканей кораллов, использование изолированных полипов недавно было предложено в качестве модели для исследований в области биологии кораллов24,25. Полипы являются анатомическими единицами кораллов, и каждый из них имеет рот, расположенный в центре их ротового диска и соединенный с другими полипами ценозарком в его аборальной области26. Разделение живых полипов происходит естественным образом путем процесса спасения полипа, при котором острый стресс вызывает переваривание ценозарка между полипами, который затем может отделиться от скелета колонии 25,27,28. Сообщалось, что это явление встречается у различных таксонов, включая октокоралов 29,30,31, черных кораллов 32 и склерактиновых кораллов 25,27,28,32,33, и было связано с многочисленными экологическими стрессорами, такими как недостаток кальция в воде 24,34, повышенная кислотность35, гиперосмотические состояния 25,27,32,36, высокие температуры 36,37, голодание33, воздействие воздуха25,30 и инсектицидное загрязнение28,38. Спасение полипа было, например, зарегистрировано в поциллопоридных кораллах19, которые широко распространены по всему миру и обычно используются в качестве моделей в исследованиях кораллов. Виды, принадлежащие к этой группе, такие как Pocillopora damicornis и Styllophora pistillata, произвели примерно 30-40 микропропагатов из 5-миллиметрового фрагмента25. Это число подчеркивает преимущество использования выручивания полипа в качестве метода микроразмножения кораллов, поскольку оно создает возможность генерации многих генетически идентичных особей из небольшого кусочка коралла. Использование изолированных полипов для исследований также имеет те же преимущества, что и клеточные культуры в отношении возможности культивирования в контролируемых лабораторных средах, таких как колбы и чашки Петри. Кроме того, микрофлюидные платформы для поддержания живых полипов продемонстрировали, что эти микрораспропагаты могут храниться в относительно дешевых и легко воспроизводимых средах с контролируемым потоком воды, поверхностью и температурой 24,25. Эти микрофлюидные платформы также могут быть использованы для визуализации живых коралловых структур под микроскопом непосредственно24,25.

В настоящей статье мы обобщаем и демонстрируем методы, которые были разработаны для выделения отдельных коралловых полипов из их колоний, показывая, как поддерживать их в лабораторных условиях для долгосрочной культуры. Обсуждаемые методы включают спасение полипа в гиперосмотических условиях путем испарения и перекачки морской воды с высокой соленостью и инкубации в морской воде без кальция.

Protocol

Для настоящего исследования колония, принадлежащая к видам кораллов Pocillopora verrucosa, была собрана с рифа Аль-Фахаль (22.305118 N; 38.964568 E) SCUBA путем погружения с использованием молотка и зубила. Род колонии был идентифицирован морфологически, а его вид был классифицирован как P. verrucosa на основе ранее опубликованных работ, в том числе Pocillopora из Красного моря, что указывает на то, что с генетической точки зрения вид, присутствующий в этой области, является P. verrucosa39,40. Риф Аль-Фахал не является частью охраняемой экологической зоны, и для сбора кораллов не требовалось никаких специальных разрешений. Колония содержалась в аквариуме объемом 300 л в течение месяца, прежде чем была фрагментирована и ее полипы «спасены». Аквариум поддерживался при температуре 26 °C с двумя аквариумными обогревателями, тремя насосами и двумя источниками света (см. Таблицу материалов), поддерживая 12-часовой световой цикл. Температуру аквариума поддерживали путем подключения каждого из двух нагревателей к регулятору температуры. Световое излучение было запрограммировано на начало в 6 утра и окончание в 6 часов вечера, создавая кривую излучения, которая достигала максимума в 12 часов дня с фотонами 230 мкмоль м−2с−1. 1. Выдерживание полипа высокой соленостью после испарения воды ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был адаптирован из Shapiro et al.25. При использовании других видов, чем Pocillopora verrucosa, размер полипов следует учитывать перед определением размера разрезаемого фрагмента. Вырезайте небольшие фрагменты (менее 1 см в длину) из колонии кораллов с помощью диагональных плоскогубцев (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптируйте режущие инструменты в соответствии с используемыми видами кораллов. Плоскогубцы полезны для резки кораллов тонкими ветвями. В текущем исследовании один фрагмент был вырезан для каждого лечения, но количество и размер фрагментов могут варьироваться в зависимости от количества желаемых полипов. Размер разрезанных осколков не должен превышать глубину воды после испарения, поэтому кораллы остаются полностью внутри воды после завершения процесса. Поместите разрезанные фрагменты в небольшие чашки Петри, наполненные 12 мл морской воды, к которой приспособилась коралловая колония. Это может быть искусственная морская вода (см. Таблицу материалов) или отфильтрованная морская вода с той же соленостью, в которую коралловая колония была вставлена до фрагментации.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно полностью покрыть фрагмент водой. Если 12 мл в чашке Петри недостаточно для покрытия разрезанного фрагмента, оптимизируйте контейнер и объем соответственно. В настоящем исследовании используемая вода была собрана из Красного моря, и ее соленость составляла 40 ПСУ, измеренная многопараметровым метром (см. Таблицу материалов). Оставьте пластину открытой в течение ~ 24 ч при температуре окружающей среды, чтобы вода могла испариться и ее соленость могла постепенно увеличиваться. Когда между полипами наблюдается переваривание тканей, перейдите к шагу 1.4.ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как время инкубации прошло, соленость воды должна быть примерно на 40% выше, чем в начале, и полипы должны быть готовы к отделению от скелета. Используя передаточную пипетку объемом 1 мл, создайте мягкий поток рядом с коралловой тканью. Поток будет медленно помогать полному отсоединению полипов, которые уже переварили ткани вокруг себя от скелета.ПРИМЕЧАНИЕ: Когда поток воды создается с пипеткой, отдельные полипы или группы полипов должны отрываться от скелета в виде хлопьев. Если вместо этого отрывается мутное вещество, это указывает на гибель или распад тканей, что означает, что кораллы инкубировались слишком долго или находились в слишком стрессовом состоянии (в данном случае высокая соленость). Очень важно сделать мягкий поток воды, чтобы отделить полипы, так как более сильный поток может привести к их физическому повреждению. Медленно замените воду в чашке Петри изосмотической водой (используйте ту же воду, что и на шаге 1.2.) с помощью пипетки. 50% водообмена в течение 10 минут достаточно, чтобы акклиматизировать полипы обратно к нестрессовому состоянию солености.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку использовались коралловые колонии поциллопоридных видов Pocillopora verrucosa из Красного моря, были проведены тесты, чтобы определить, при каких конкретных условиях кораллы из этой уникальной среды спасутся. Важно подчеркнуть высокую соленость Красного моря по сравнению с большинством других рифовых сред. 2. Спасение полипа высокой соленостью морской воды ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был адаптирован из Chuang et al.27. Приготовьте 3 л морской воды с высокой соленостью, добавив NaCl в морскую воду до тех пор, пока соленость не увеличится на 85%, измеренная зондом солености.ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании была получена морская вода с высокой соленостью 74 PSU из морской воды 40 PSU из Красного моря. Вырежьте небольшие фрагменты кораллов, как описано в Шаге 1.1. Поместите разрезанные фрагменты в контейнер объемом 10 л, заполненный 3 л изосмотической морской воды (в данном случае морской воды с нестрессовой соленостью для кораллов, такой же, как используется на этапе 1.2), подключенный к перистальтическому насосу (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего поддержания здоровья кораллов могут быть добавлены регуляторы температуры, воздушные насосы и освещение для имитации тех же условий аквариума, которым колония подвергалась ранее. Во время инкубации в настоящей работе фрагменты кораллов хранились в контейнерах при 26 °C, в течение 12-часового суточного светового цикла. Движение воды и гомогенизация температуры поддерживались воздушными насосами. Наполните контейнер, содержащий фрагменты кораллов, морской водой с высокой соленостью, приготовленной на этапе 2.1 с помощью перистальтического насоса в течение 24 ч со скоростью 126 мл/ч. Добавьте в общей сложности 3 л воды при увеличении солености примерно на 40%.ПРИМЕЧАНИЕ: Вода с высокой соленостью может быть получена путем простого добавления NaCl в морскую воду до достижения намеченной солености. Создайте мягкий поток воды с пипеткой, чтобы освободить полипы от скелета (Шаг 1.4.). Медленно обменивайте воду, в которой содержатся полипы, на изосмотическую воду (Шаг 1.5.). Затем перейдите к шагу 4 или шагу 5. 3. Извлечение полипа путем инкубации морской воды без кальция ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был адаптирован из Pang et al.24. Готовят раствор искусственной морской воды без кальция (CaFSW), добавляя 26,29 г NaCl, 0,872 г KCl, 2,16 г MgSO4, 11,94 г MgCl2, 3,42 гNa2SO4 и 0,286 г NaHCO3 (см. Таблицу материалов) к 1 л деионизированной воды.ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение было скорректировано с предыдущих протоколов, чтобы лучше подходить для кораллов, адаптированных к солености 40 PSU. Для кораллов, адаптированных к другим условиям солености, используйте ту же пропорцию солей, но отрегулируйте общую массу растворенных веществ, чтобы получить соленость, которая лучше подходит для используемых кораллов. Вырежьте небольшие фрагменты кораллов, как описано в Шаге 1.1. Погрузите фрагменты кораллов в чашки Петри, заполненные ранее приготовленным CaFSW (шаг 3.1.), и инкубируйте их в орбитальных инкубаторах со скоростью вращения 80 об/мин в течение 3 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, важно полностью покрыть фрагмент водой. Если чашки Петри недостаточно для покрытия фрагмента, оптимизируйте контейнер и объем в соответствии с экспериментальной потребностью. Переложите фрагменты в чашки Петри или 6-луночные пластины, заполненные 20% модифицированной средой Dulbecco ‘s Modified Eagle Media (DMEM) и 100 мг/мл раствора ампициллина (см. Таблицу материалов), приготовленной из искусственной морской воды 40 PSU. Инкубируйте фрагменты при 26 °C и 80 об/мин, обмениваясь средой каждый день, пока не будет наблюдаться переваривание тканей между полипами и отдельные полипы не начнут отделяться от скелета.ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев переваривание тканей завершается в течение 20 ч после инкубации в этой среде, и обмены не требуются. Переложите полипы в стерилизованную морскую воду для первоначального восстановления с помощью пипетки. После 1 ч инкубации перейдите к Этапу 4 или Шагу 5. 4. Уход за полипами в чашках Петри Как только полипы будут возвращены в отфильтрованную морскую воду с ненапрягающей соленостью, выберите жизнеспособные полипы, наблюдая за целостностью и движением тканей, вызванным цилиарным потоком под стереомикроскопом. Поместите выбранные полипы в стеклянную или пластиковую чашку Петри и накройте чашку Петри планктонной сеткой (размер ячеек 200 мкм, см. Таблица материалов), чтобы полипы не отплывали от чашки.ПРИМЕЧАНИЕ: Размер сетчатой сетки может варьироваться в зависимости от размера полипов. Важно отметить, что сетки должны иметь поры, которые меньше полипов и допускают водообмен и проникновение света. Поместите чашку Петри в аквариум с соответствующими условиями для используемых видов кораллов.ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании условия были 40 PSU, отфильтрованная морской водой при 26 °C и 12-часовой световой цикл. Открывайте чашки Петри не реже одного раза в неделю, чтобы обновить воду и очистить посуду. Этот шаг важен для устранения чрезмерного роста водорослей, который может конкурировать или повреждать коралловые полипы, локально высвобождая токсичные соединения. 5. Содержание полипов в инкубаторах Выберите жизнеспособные полипы, как описано в шаге 4.1. Поместите полипы в колбы поверхностных клеток размером 75см2 , заполненные 50 мл изосмотической морской воды с помощью переносных пипеток.ПРИМЕЧАНИЕ: В текущей работе фильтрованная морская вода, собранная из Красного моря, использовалась для поддержания полипа. Можно использовать воду с теми же характеристиками, что и на этапе 1.2. Закройте колбы и переместите их в инкубаторы. Установите в инкубаторах 12-часовые световые циклы при 26 °C и 40 об/мин. Обменивайте 50% объема воды каждые 4 дня и переносите содержимое в чистые колбы, когда / если они наполняются водорослями или биопленкой на стенах.ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были получены с помощью полностью апохроматической системы зума, оснащенной HD-камерой (см. Таблицу материалов) для репрезентативных результатов.

Representative Results

Спасение полипа было индуцировано в фрагментах кораллов, принадлежащих к одной колонии вида P. verrucosa, тремя различными методами (рисунок 1). Спасение, вызванное высокой соленостью после испарения воды, было завершено после 24 ч инкубации фрагментов кораллов в чашках Петри при температуре окружающей среды, заполненных водой, первоначально при 40 ПС, которая затем достигла конечной солености 59 ПГУ после завершения процесса (рисунок 2A-C, I). Спасение с помощью подачи соленой воды также было достигнуто после 24 ч инкубации в воде первоначально при 40 блоках питания, которые достигли солености 52 блока питания через 12 ч и 59 блоков питания в конце процесса, через 24 ч (рисунок 2D-F,I). В обоих экспериментах увеличение солености было ответственно за индукцию переваривания тканей полипами. Через 12 ч состояние высокой солености вызывало сокращение полипов в сочетании с постепенным истончением ценозарка, в конечном итоге вызывая окончательное отслоение полипов через 24 ч. Индукция спасения путем инкубации в морской воде без кальция была завершена после 3-часовой инкубации в CaFSW с последующей 20-часовой инкубацией в 20% среде DMEM (рисунок 2G-H). Ткань отделялась от скелета во всех трех методах после отталкивания его пипеткой до тех пор, пока не были сгенерированы индивидуализированные коралловые полипы (рисунок 3A-C) и «тканевые шарики». После отсоединения полипы всех трех методов собирали и позволяли восстанавливаться в морской воде, прежде чем распределять в чашки Петри, покрытые сетями или клеточными колбами. Полипы, полученные методами испарения и водоснабжения, поддерживались в чашках Петри внутри аквариумов и выживали в течение 6 недель и 8 недель соответственно (рисунок 3D и рисунок 3F). Эти микропропагаты сохранили обычную анатомию полипов, представляющих щупальца, базальные диски и устья1. Полипы, полученные путем инкубации в безкальцевой морской воде, имели короткую продолжительность жизни, выживая до 1 дня, после чего их ткани диссоциировали. Полипы, полученные методом испарения морской воды, хранящиеся в колбах клеточных культур внутри инкубаторов, выживали до 3 недель без диссоциации тканей (рисунок 3F). Во всех случаях, несмотря на то, что полипы не могли прикрепляться к субстрату, они были визуально здоровы и сохраняли свой цвет, причем клетки зооксантелл все еще были видны внутри их тканей1. Рисунок 1: Схематическое представление трех различных проверенных методологий индукции выручивания полипа (слева) с последующей иллюстрацией двух методов поддержания приобретенных полипов в лабораторных условиях (справа). (A) Представление методологии спасения полипа путем испарения воды. (B) Представление методологии спасения полипа путем подачи морской воды с высокой соленостью. С) Представление методологии спасения полипа путем инкубации морской воды без кальция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Изображения процесса спасения полипа, индуцированного тремя различными методологиями с использованием фрагментов кораллового вида P. verrucosa. (А-С) Фрагмент коралла через 0 ч, 12 ч и 24 ч после инкубации, соответственно, в чашке Петри с использованием метода испарения воды. (Д-Ф) Фрагмент коралла через 0 ч, 12 ч и 24 ч после инкубации, соответственно, с использованием метода подачи морской воды с высокой соленостью. (Г,Ч) Фрагменты кораллов подвергаются воздействию метода инкубации морской воды без кальция до и после, соответственно. Инкубации в искусственной морской воде без кальция проводились в течение 3 ч и в 20% DMEM в течение 21 ч. (I) Графическое представление значений солености в ПГУ морской воды с течением времени во время испарения воды и методов индукции спасения морской воды с высокой соленостью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Изображения полипов P. verrucosa, полученные из трех продемонстрированных процедур индукции спасения. (A-C) Изображения полипов, полученные из методов испарения, подачи соленой воды и морской воды без кальция, соответственно, были получены сразу после того, как они были отделены от скелета. (D) Изображение кораллового полипа, полученное методом испарения после выживания в течение 6 недель в чашке Петри. (E) Изображение кораллового полипа, полученное методом подачи соленой воды после выживания в течение 8 недель в чашке Петри. (F) Изображение кораллового полипа, полученное методом испарения после выживания в течение 3 недель в колбе для клеточной культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Выживаемость полипов после того, как они были подвергнуты процессам спасения, и время, необходимое для завершения процесса, варьируются среди ранее сообщенных исследований 25,33,41, что, возможно, объясняется различными экспериментальными подходами, применяемыми в каждом исследовании. Например, различные виды кораллов или даже кораллы одного и того же вида, но акклиматизированные к различным условиям окружающей среды (например, кораллы из Красного моря), имеют разные пороговые значения для уровней солености. Выбранный метод спасения и лабораторные / аквариумные условия также играют важную роль в результатах. В некоторых случаях поддержание микрораспространения кораллов в лабораторных условиях превзошло время выживания культур коралловых клеток, достигнув месяцев выживания у азооксантеллата3 3,41 и зооксантеллата25 кораллов. Время завершения процесса спасения полипа также варьировалось в различных исследованиях, варьируясь от нескольких часов2 5,2 7,30 донедель 35 инкубации, подвергшейся воздействию стрессора, ответственного за спасение. Другой переменной, которую следует учитывать при изучении спасения полипа, является восстановление полипов после воздействия острого стресса, который вызвал их высвобождение. До сих пор спорно, находятся ли полипы после спасения в достаточно хорошем состоянии, чтобы их можно было использовать в качестве моделей для изучения биологии кораллов. Восстановление их тканей после деградации ценозарка вызывает беспокойство при использовании этих микропропагатов. Тем не менее, полипы во многих исследованиях, включая настоящие, смогли представить клетки зооксантелл внутри своих тканей и внешних морфологий с интактной орально-аборальной поляризацией и щупальцами через несколько недель после спасения 25,27,32,36. Предыдущие исследования также показали, что после освобождения от острого стресса высвобождаемые коралловые полипы, подвергшиеся воздействию сильно соленой или нагретой морской воды, смогли восстановить экспрессию генов, связанных с такими процессами, как апоптоз, протеолиз и деление клеток до уровней, аналогичных тем, которые были обнаружены до спасения32,36, и даже увеличить экспрессию генов, связанных с заживлениемтканей 36.

Что касается разницы в выживаемости между методами, важно подчеркнуть, что это время может варьироваться между различными экспериментами, даже если используются одни и те же методы, и это может быть связано со здоровьем используемых фрагментов и правильным поддержанием полипов после процесса спасения. В случае спасения через инкубацию морской воды без кальция выживаемость полипа была ограничена 1 днем. Таким образом, можно сделать вывод, что метод не очень хорошо подходит для длительного выживания исследуемого вида, либо должна быть произведена лучшая адаптация методики для кораллов P. verrucosa из Красного моря. Представленные результаты показали, что более длительное время выживания было получено с помощью методов, основанных на постепенном увеличении солености, когда полипы подвергались капанию воды с высокой соленостью. Этот метод может обеспечить более контролируемое увеличение солености, чем метод испарения, в то же время не отвечая за увеличение концентрации других веществ, обнаруженных в морской воде, включая метаболические отходы кораллов, которые потенциально токсичны для организма. По всем этим причинам этот метод был предложен в качестве более безопасной альтернативы для поддержания здоровых полипов27. Хотя предполагается, что этот метод более безопасен для здоровья полипов и способен производить полипы, которые живут дольше, факт, который был подтвержден в этой текущей публикации, для его подтверждения необходимы дополнительные обследования. Оба эксперимента с высокой соленостью, вызванные спасением, продемонстрировали полное отделение полипов после того, как соленость достигла 59 ПГУ за 24 часа. Если соленость увеличивается выше уровня, на котором спасение завершено, дальнейший стресс будет вызван полипами, уменьшая их шансы на выживание и восстановление после лечения острого стресса. Поэтому не рекомендуется дольше поддерживать полипы при таких уровнях солености. При выполнении метода индукции спасения путем воздействия морской воды без кальция была получена полная отслойка от 3-часовой инкубации в искусственной морской воде без кальция, что означает, что дальнейшее воздействие этой среды также не рекомендуется.

Чтобы рассмотреть методы, которые были более адекватными для изучения коралловых полипов в лабораторных / экстракорпоральных исследованиях, это исследование было сосредоточено только на трех процедурах, которые заняли около 24 часов для завершения процесса спасения и использовались в исследованиях, которые включали долгосрочное поддержание коралловых полипов из склерактиновых кораллов. Другие методы, которые, как сообщается, занимают значительно больше времени, чем в это время, не были задействованы. Поселение полипов в подложку не было предпринято в этом исследовании, которое было сосредоточено на производстве полипов, которые могут быть перенесены в различные среды или легко собраны для анализа с использованием одноразовых пипеток. Результаты показывают, что полипы кораллового вида P. verrucosa поддерживались живыми с ассоциированными клетками зооксантелл, здоровым визуальным статусом и сохраненной грубой внешней анатомической структурой в течение 8 недель, даже без прикрепления к субстрату. Эти результаты показывают, что больше биологических реплик может быть получено из отдельных фрагментов кораллов с использованием некоторых методов, продемонстрированных в этом исследовании. Такие биологические реплики могут храниться в контролируемых средах (таких как чашки Петри и клеточные колбы) и поддерживаться в лабораторных условиях для месячных экспериментов и использоваться для нескольких целей.

Со времени первых случайных описаний спасения полипа 42,43 были созданы новые протоколы для поиска более стандартизированных методов индуцирования высвобождения полипа и поддержания таких полипов живыми, которые могут быть использованы для будущих исследовательских приложений. К ним относятся исследование различных аспектов, связанных с физиологией кораллового холобиона44 и взаимодействиями хозяина и микробиома45, молекулярных механизмов, участвующих в обесцвечивании кораллов 5,25, и здоровья, устойчивости и защиты кораллового холобиона 12,13,46,47 . Кроме того, выпущенные коралловые полипы могут быть использованы для приложений за пределами сферы исследований и были предложены для создания пропагул, которые могут прикрепляться к субстрату и расти, потенциально создавая несколько коралловых особей, которые могут быть использованы в целях восстановления, как только стандартизированные протоколы для спасения станут широко распространенными28 . В целом, хотя для стандартизации методологии следует проводить более углубленные эксперименты с использованием спасенных полипов, было показано, что спасение полипа является воспроизводимым подходом, который может быть применен в качестве инструмента в исследованиях кораллов для нескольких целей.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Адама Барно и Франциску Гарсию за их поддержку в экспериментах и мониторинге коралловых полипов. Мы также благодарим KAUST Coastal & Marine Resources Core Lab за помощь в обслуживании аквариумов и инфраструктуре. Исследование финансировалось за счет гранта KAUST No BAS/1/1095-01-01.

Materials

5560 Conductivity/Temperature Probe YSI 5560 Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter
Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers Ace Hardware 2004083 Used to cut coral fragments
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518 Used in DMEM medium.
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41965-039 Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene Thermo Fisher Scientific FB0875713A Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt Schego 548 Heaters used in aquarium
Leica Application Suite Version 4.2 Leica Microsystems NA Software used for image capture in demonstrative results
Leica IC80 HD Leica Microsystems 12730216 Camera used to take demonstrative results pictures
Leica MDG33 Leica Microsystems 10 450 123 Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures
Leica Z6 APO Leica Microsystems NA Macroscope used to take demonstrative results pictures
Magnesium Chloride Thermo Fisher Scientific 7487-88-9 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Magnesium Sulfate Anhydrous Sigma-Aldrich 7791-18-6 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor Masterflex HV-77602-10 Peristaltic pump head.
Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller Masterflex EW-07557-00 Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft Masterflex HV-96410-16 Tubing for peristaltic pump.
Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO Sigma-Aldrich SLGVR33RS Used to filter artificial sea water.
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface Thermo Fisher Scientific 156499 Flask usually used for cell culture used for polyp culture.
Orbital shaker, Advanced 5000, VWR VWR 444-2916 Shaker used inside incubator.
Percival Incubator – I-22VL Percival NA Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.
Plankton net 200 µm mesh size KC Denmark NA Used for covering petri dishes containing coral polyps.
Potassium Chloride VWR Chemicals 7447-40-7 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
ProQuatro Multiparameter Meter YSI 606950 Used for measuring salinity thoughout the protocol
RADION XR15 G5 PRO Ecotech NA Lights used in aquarium
Red Sea Salt
Premium grade, moderate Alkalinity		 Red Sea NA Used to prepare 40 PSU artifical sea water.
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Sodium Sulfate Anhydrous VWR Chemicals 7757-82-6 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
TRD 112 thermostat Schego NA Thermostat used in aquarium
Turbelle Nanostream 6025 Tunze 6025 000 Pumps used in aquarium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goffredo, S., Dubinsky, Z. . The Cnidaria, Past, Present and Future: The World of Medusa and her Sisters. , (2016).
  2. Knowlton, N., et al. Rebuilding coral reefs: a decadal grand challenge. International Coral Reef Society and Future Earth Coasts. , 56 (2021).
  3. Brown, B. Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs. 16 (1), 129-138 (1997).
  4. Douglas, A. Coral bleaching–how and why. Marine Pollution Bulletin. 46 (4), 385-392 (2003).
  5. Nielsen, D. A., Petrou, K., Gates, R. D. Coral bleaching from a single cell perspective. The ISME Journal. 12 (6), 1558-1567 (2018).
  6. Oakley, C. A., Davy, S. K. . Coral Bleaching: Patterns, Processes, Causes and Consequences. Coral Bleaching Book. , 189-211 (2018).
  7. Donner, S. D., Heron, S. F., Skirving, W. J. Future scenarios: a review of modelling efforts to predict the future of coral reefs in an era of climate change. Coral Bleaching. , 159-173 (2009).
  8. Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world’s coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
  9. Hughes, T. P., et al. Global warming impairs stock-recruitment dynamics of corals. Nature. 568 (7752), 387-390 (2019).
  10. Moore, J. A., et al. Unprecedented mass bleaching and loss of coral across 12 of latitude in Western Australia in 2010-11. PLoS One. 7 (12), 51807 (2012).
  11. Duarte, G. A., et al. Heat waves are a major threat to turbid coral reefs in Brazil. Frontiers in Marine Science. 7, 179 (2020).
  12. Santoro, E. P., et al. Coral microbiome manipulation elicits metabolic and genetic restructuring to mitigate heat stress and evade mortality. Science Advances. 7 (33), (2021).
  13. Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
  14. Debergh, P. C., Read, P. E. . Micropropagation. 1, 1-13 (1991).
  15. Nitish, K., Reddy, M. P. In vitro plant propagation: a review. Journal of Forest and Environmental Science. 27 (2), 61-72 (2011).
  16. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  17. Yao, T., Asayama, Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reproductive Medicine and Biology. 16 (2), 99-117 (2017).
  18. Merten, O. W. Introduction to animal cell culture technology-past, present and future. Cytotechnology. 50 (1-3), 1 (2006).
  19. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. P. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  20. Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
  21. Lecointe, A., et al. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps. Cytotechnology. 65 (5), 705-724 (2013).
  22. Nowotny, J. D., Connelly, M. T., Traylor-Knowles, N. Novel methods to establish whole-body primary cell cultures for the cnidarians Nematostella vectensis and Pocillopora damicornis. Scientific Reports. 11 (1), 1-9 (2021).
  23. Kawamura, K., Nishitsuji, K., Shoguchi, E., Fujiwara, S., Satoh, N. Establishing sustainable cell lines of a coral, Acropora tenuis. Marine Biotechnology. 23, 373-388 (2021).
  24. Pang, A. -. P., Luo, Y., He, C., Lu, Z., Lu, X. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  25. Shapiro, O. H., Kramarsky-Winter, E., Gavish, A. R., Stocker, R., Vardi, A. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  26. Tambutté, S., et al. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 408 (1-2), 58-78 (2011).
  27. Chuang, P. -. S., Mitarai, S. Signaling pathways in the coral polyp bail-out response. Coral Reefs. 39 (6), 1535-1548 (2020).
  28. Schweinsberg, M., Gösser, F., Tollrian, R. The history, biological relevance, and potential applications for polyp bail-out in corals. Ecology and Evolution. 11 (13), 8424-8440 (2021).
  29. Rakka, M., et al. First description of polyp bail-out in cold-water octocorals under aquaria maintenance. Coral Reefs. 38 (1), 15-20 (2019).
  30. Wells, C. D., Tonra, K. J. Polyp bail-out and reattachment of the abundant Caribbean octocoral Eunicea flexuosa. Coral Reefs. 40 (1), 27-30 (2021).
  31. Coppari, M., et al. Unveiling asexual reproductive traits in black corals: polyp bail-out in Antipathella subpinnata. Coral Reefs. 39 (6), 1517-1523 (2020).
  32. Chuang, P. S., Ishikawa, K., Mitarai, S. Morphological and genetic recovery of coral polyps after bail-out. Frontiers in Marine Science. 8, 280 (2021).
  33. Serrano, E., Coma, R., Inostroza, K., Serrano, O. Polyp bail-out by the coral Astroides calycularis (Scleractinia, Dendrophylliidae). Marine Biodiversity. 48 (3), 1661-1665 (2018).
  34. Kopecky, E. J., Ostrander, G. K. Isolation and primary culture of viable multicellular endothelial isolates from hard corals. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 35 (10), 616-624 (1999).
  35. Kvitt, H., et al. Breakdown of coral colonial form under reduced pH conditions is initiated in polyps and mediated through apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2082-2086 (2015).
  36. Gösser, F., Raulf, A., Mosig, A., Tollrian, R., Schweinsberg, M. Signaling pathways of heat-and hypersalinity-induced polyp bail-out in Pocillopora acuta. Coral Reefs. 40 (6), 1713-1728 (2021).
  37. Fordyce, A. J., Camp, E. F., Ainsworth, T. D. Polyp bail-out in Pocillopora damicornis following thermal stress. F1000Research. 6, 687 (2017).
  38. Wecker, P., et al. Exposure to the environmentally-persistent insecticide chlordecone induces detoxification genes and causes polyp bail-out in the coral P. Damicornis. Chemosphere. 195, 190-200 (2018).
  39. Schmidt-Roach, S., Miller, K. J., Lundgren, P., Andreakis, N. With eyes wide open: a revision of species within and closely related to the Pocillopora damicornis species complex (Scleractinia; Pocilloporidae) using morphology and genetics. Zoological Journal of the Linnean Society. 170 (1), 1-33 (2014).
  40. Gélin, P., Postaire, B., Fauvelot, C., Magalon, H. Reevaluating species number, distribution and endemism of the coral genus Pocillopora Lamarck, 1816 using species delimitation methods and microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 430-446 (2017).
  41. Capel, K. C. C., Migotto, A., Zilberberg, C., Kitahara, M. V. Another tool towards invasion? Polyp "bail-out" in Tubastraea coccinea. Coral Reefs. 33 (4), 1165 (2014).
  42. Kawaguti, S. Materials for the study of reef-building corals III. Science of the South Sea (Kagaku Nanyo). 5, 95-106 (1942).
  43. Goreau, T. F., Goreau, N. I. The physiology of skeleton formation in corals. II. Calcium deposition by hermatypic corals under various conditions in the reef. Biological Bulletin. 117, 239-250 (1959).
  44. Swain, T. D., et al. Physiological integration of coral colonies is correlated with bleaching resistance. Marine Ecology Progress Series. 586, 1-10 (2018).
  45. Sweet, M., et al. Insights into the cultured bacterial fraction of corals. mSystems. 6 (3), 01249 (2020).
  46. Peixoto, R. S., Rosado, P. M., Leite, D. C. d. A., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial microorganisms for corals (BMC): proposed mechanisms for coral health and resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
  47. Peixoto, R. S., et al. Coral probiotics: premise, promise, prospects. Annual Review of Animal Biosciences. 9, 265-288 (2021).

Tags

Coral MicropropagationPolyp Bail-outCoral FragmentsCoral PhysiologyCoral BleachingCoral ProbioticsSalinitySeawaterCoral ColonyIsosmotic WaterHigh-salinity SeawaterPeristaltic Pump

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cardoso, P. M., Alsaggaf, A. A., Villela, H. M., Peixoto, R. S. Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use. J. Vis. Exp. (182), e63840, doi:10.3791/63840 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image