サンゴのコロニーでポリープ救済を誘導して、実験室での実験的使用のための個別化されたマイクロ増殖物を得る

本研究では、スキューバがハンマーとチゼルを用いて潜水することにより、アル・ファハル礁(22.305118 N; 38.964568 E)からポシロポラ・ベルコササンゴ種に属するコロニーを採取した。コロニーの属は形態学的に同定され、その種は紅海からのポシロポラを含む以前に発表された研究に基づいてP. verrucosaとして分類され、遺伝的観点から、この地域に存在する種はP. verrucosa39,40であることを示している。アルファハル礁は保護された環境地域の一部ではなく、サンゴの収集に特別な許可は必要ありませんでした。コロニーは300Lの水槽に1ヶ月間保管された後、断片化され、ポリープが「救済」されました。水槽は、2つの水槽ヒーター、3つのポンプ、および2つの光源(材料表を参照)で26°Cに保たれ、12時間の光サイクルを維持した。水槽の温度は、2つのヒーターのそれぞれを温度調節器に接続することによって維持された。発光は午前6時に開始し、午後6時に終了するようにプログラムされ、230μmolの光子m−2s−1で午後12時にピークに達する放射照度曲線を生じた。 1.水分蒸発後の高塩分濃度によるポリープ救済 注:この方法は、Shapiroら25から適応されました。 Pocillopora verrucosaとは異なる種を使用する場合、切断する断片のサイズを決定する前に、ポリープのサイズを考慮する必要があります。 斜めの切断ペンチを使用して、サンゴのコロニーから小さな破片(長さ1cm未満)を切断します( 材料表を参照)。注:使用しているサンゴの種類に応じて切削工具を適応させてください。斜めのペンチは、細い枝を持つサンゴを切るのに便利です。現在の研究では、各治療ごとに1つの断片を切断したが、断片の数およびサイズは、所望のポリープの数に応じて変化し得る。切断された断片のサイズは蒸発後の水の深さを超えてはならないので、サンゴはプロセスが完了した後も完全に水中にとどまります。 切り取った破片を、サンゴのコロニーが順応した12mLの海水で満たされた小さなペトリ皿に入れます。これは、人工海水( 材料表を参照)または断片化前にサンゴコロニーが挿入されたのと同じ塩分濃度でろ過された海水であり得る。注:破片を水で完全に覆うことが重要です。シャーレに12mLを入れても切断断片を覆うのに十分でない場合は、それに応じて容器と容量を最適化します。本研究では、利用された水を紅海から採取し、その塩分濃度はマルチパラメータメーターで測定した40PSUであった( 材料表参照)。 プレートを周囲温度で約24時間開いたままにして、水が蒸発し、塩分濃度が徐々に増加するようにします。ポリープ間で組織の消化が観察可能な場合は、ステップ1.4に進みます。注:インキュベーション時間が経過した後、水の塩分濃度は最初よりも約40%高くなければならず、ポリープは骨格から剥離する準備ができている必要があります。 1 mLのトランスファーピペットを使用して、サンゴ組織の近くに穏やかな流れを作り出します。流れは、すでに骨格から周囲の組織を消化したポリープの完全な剥離をゆっくりと助けます。注: ピペットで水流を作成すると、個別のポリープまたはポリープのグループがフレークとしてスケルトンから取り外される必要があります。代わりに白濁した物質が剥がれると、それは組織の死または崩壊を示し、それはサンゴがあまりにも長い間、またはあまりにもストレスの多い状態(この場合は高い塩分濃度)でインキュベートされたことを意味します。より強い流れがポリープに物理的な損傷を与える可能性があるため、ポリープを取り外すために穏やかな水の流れを作ることは非常に重要です。 ピペットを使用して、シャーレ内の水を等沸水(ステップ1.2と同じ水を使用)とゆっくりと交換します。10分間の50%の水交換は、ポリープをストレスの多い塩分濃度の状態に戻すのに十分です。注:紅海のポシロポリッド種 ポシロポラ・ベルコサ のサンゴコロニーが使用されたため、このユニークな環境からのサンゴがどの特定の条件下で救済されるかを決定するためのテストが行われました。他のほとんどのサンゴ礁環境と比較して、紅海の高い塩分濃度を強調することが重要です。 2. 高塩分濃度海水供給によるポリープ救済 注:この方法はChuangら27から適応された。 塩分濃度プローブで測定し、塩分濃度が85%増加するまで海水にNaClを加えて塩分濃度の高い海水を3L用意する。注:現在の研究では、紅海からの40 PSU海水から74 PSUの高塩分濃度海水が調製されました。 手順1.1で説明したようにサンゴの小さな破片を切断します。 切断した破片を、蠕動ポンプに接続された3Lの等沸性海水(この場合、サンゴのストレスの多い塩分濃度のない海水、ステップ1.2で使用したものと同じ)で満たされた10L容器に入れます( 材料表を参照)。注:サンゴの健康をよりよく維持するために、温度コントローラ、エアポンプ、およびライトを追加して、コロニーが以前に暴露されたのと同じ水槽の状態をシミュレートすることができます。本作業におけるインキュベーションの間、サンゴ断片を26°Cの容器に保持し、毎日12時間の光サイクル下で保持した。水の動きと温度の均質化は、エアポンプによって維持されました。 工程2.1で調製した高塩分濃度海水を、蠕動ポンプで126mL/hの速度で24時間、サンゴの破片を入れた容器に充填します。塩分濃度を約40%増加させて合計3Lの水を加えます。注:塩分濃度の高い水は、意図した塩分濃度に達するまで海水にNaClを加えるだけで生成できます。 ピペットで穏やかな水流を作り、ポリープを骨格から解放します(ステップ1.4)。 ポリープが入っている水をゆっくりと等沸水に交換する(ステップ1.5)。次に、手順 4 または手順 5 に進みます。 3. カルシウムフリー海水インキュベーションによるポリープ救済 注:この方法は、Pang et al.24から適応されました。 脱イオン水1LにNaCl26.29g、KCl0.872g、MgSO42g、MgCl21.94g、Na2SO43.42g、NaHCO30.286g(材料表参照)を加えて、カルシウムフリー人工海水(CaFSW)溶液を調製する。注:このソリューションは、40 PSUの塩分濃度に適合したサンゴにより適しているように、以前のプロトコルから調整されました。他の塩分濃度条件に適応したサンゴの場合、同じ割合の塩を使用しますが、溶質の総質量を調整して、使用中のサンゴにより適した塩分濃度を得ます。 手順 1.1 で説明したようにサンゴの小さな断片を切断します。 サンゴの破片を以前に調製したCaFSWで満たされたペトリ皿に沈め(ステップ3.1)、80rpmの回転速度で3時間軌道インキュベーターでインキュベートします。注:繰り返しますが、フラグメントを完全に水で覆うことが重要です。シャーレで断片を覆うのに十分でない場合は、実験の必要性に応じて容器と容量を最適化します。 断片を、20%ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)と40 PSU人工海水で調製した100 mg/mLのアンピシリン溶液( 材料表を参照)で満たされたペトリ皿または6ウェルプレートに移します。断片を26°Cおよび80rpmでインキュベートし、ポリープと個々のポリープとの間の組織消化が観察可能になるまで毎日培地を交換し、骨格から剥離し始める。注:ほとんどの場合、組織消化はこの培地でのインキュベーションから20時間以内に完了し、交換は必要ありません。 ピペットを用いて初期回収のためにポリープを滅菌海水に移す。1時間のインキュベーション後、ステップ4またはステップ5に進みます。 4. ペトリ皿のポリープ維持 ポリープが非ストレス性塩分濃度でろ過された海水に戻されたら、実体顕微鏡下で毛様体の流れによって引き起こされる組織の完全性と動きを観察して、生存可能なポリープを選択します。 選択したポリープをガラスまたはプラスチックのペトリ皿に入れ、ポリープが皿から浮かび上がらないようにプランクトンネット(200μmメッシュサイズ、 材料表を参照)でペトリ皿を覆います。メモ: メッシュネットのサイズは、ポリープのサイズによって異なります。ネットはポリープよりも小さく、水の交換と光の浸透を可能にする毛穴を持たなければならないことに注意することが重要です。 使用するサンゴ種に適した条件で水槽内にペトリ皿を置きます。注:本研究では、条件は26°Cで40 PSUろ過海水と12時間の光サイクルでした。 少なくとも週に1回はペトリ皿を開けて水を新しくし、皿をきれいにします。このステップは、有毒化合物を局所的に放出することによってサンゴポリープと競合または損傷する可能性のある藻類の過剰増殖を排除するために重要です。 5. インキュベーター内のポリープメンテナンス ステップ4.1で説明したように、生存可能なポリープを選択します。 移送ピペットを用いて、50mLの等沸性海水で満たされた75cm2表面細胞フラスコにポリープを置く。注:今回の作業では、紅海から採取したろ過海水をポリープのメンテナンスに使用しました。ステップ1.2で使用した水と同じ特性の水を使用できます。 フラスコを閉じ、インキュベーターに移動します。インキュベーターを26°C、40rpmで12時間の光サイクルに設定します。4日ごとに水量の50%を交換し、壁に藻類やバイオフィルムがいっぱいになったら、内容物をきれいなフラスコに移します。注:画像は、代表的な結果のためにHDカメラ( 材料表を参照)を備えた完全アポクロマチックズームシステムでキャプチャされました。