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Biology

Induktion der Polypenrettung in Korallenkolonien, um individualisierte Mikropropagate für den experimentellen Laboreinsatz zu erhalten

Published: April 28, 2022
doi:
10.3791/63840
, , ,
1Red Sea Research Center (RSRC), Division of Biological and Environmental Science and Engineering (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Polypen-Bail-out ist ein Prozess, der durch akuten Stress induziert wird, bei dem Korallenpolypen das Gewebe verdauen, das sie mit ihrer Kolonie verbindet, und sich von ihr lösen, um als Individuen zu leben. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie die Mikrovermehrung von Korallen durch Bail-out mit hypersalinen oder kalziumfreien Meerwasserbehandlungen induziert werden kann.

Abstract

Korallen sind koloniale Tiere, die aus modularen Einheiten bestehen, die Polypen genannt werden. Korallenpolypen sind physiologisch verbunden und durch Gewebe verbunden. Das Phänomen des Polypen-Bail-outs ist ein Prozess, der durch akuten Stress induziert wird, bei dem Korallenpolypen das Gewebe verdauen, das sie mit dem Rest der Kolonie verbindet, und sich schließlich vom Skelett lösen, um als separate Individuen weiterzuleben. Korallenbiologen haben den Prozess der Polypenrettung seit Jahren anerkannt, aber erst kürzlich wurden die durch diesen Prozess erzeugten Mikrovermehrungen als Modellsystem für korallenbiologische Studien anerkannt. Die Verwendung von Polypen-Bail-out kann eine hohe Anzahl von klonalen Einheiten aus einem einzigen Korallenfragment erzeugen. Ein weiterer Vorteil ist, dass einzelne Polypen oder Polypenflecken leicht unter einem Mikroskop sichtbar gemacht und in hochstandardisierten, kostengünstigen Umgebungen wie Petrischalen, Kolben und mikrofluidischen Chips gewartet werden können. Das vorliegende Protokoll zeigt reproduzierbare Methoden, die in der Lage sind, die Mikrovermehrung von Korallen zu induzieren, und verschiedene Ansätze, um die einzelnen Polypen langfristig am Leben zu erhalten. Diese Methodik war in der Lage, Polypen der Korallenart Pocillopora verrucosa bis zu 8 Wochen nach der Rettung erfolgreich zu kultivieren, was die Praktikabilität der Verwendung einzelner Korallenpolypen für die Korallenforschung zeigte.

Introduction

Skleraktinische oder riffbildende Korallen sind Nesseltiere, die in der Lage sind, Karbonatskelette zu bilden, Riffe und strukturell komplexe Ökosysteme zu schaffen, die von tiefen bis hin zu flachen Wasserumgebungen gefunden werden können1. Tropische Korallenriffe beherbergen eine hohe Biodiversität und erbringen wesentliche Ökosystemdienstleistungen wie Küstenschutz und Fischereierhaltung2. Die meisten Flachwasserriff-bildenden Korallen beruhen auf einer mutualistischen Beziehung zu Algen der Familie Symbiodiniaceae, die die Energie liefern, die Korallen benötigen, um ihre Skelette zu bauen. Die Symbiose zwischen Koralle und Alge kann durch Umweltstress unterbrochen werden, was zu Korallenbleiche führt 3,4,5,6. Jüngste Temperaturanomalien haben weltweit zu großen Korallenbleichereignissen geführt, die zu einem Massenkorallensterben und einer dauerhaften Verschlechterung der Riffe geführthaben 7,8,9,10,11. Da dieses Phänomen auf der Vertreibung von Symbionten durch post-Hitzestress-assoziierte zelluläre Mechanismen wie Apoptose, Autophagie und Exozytose basiert, kann Korallenbleiche als ein zellulärer Prozess beschrieben werden, der Auswirkungen auf Ökosystemebene hat 5,6,12, was bedeutet, dass In-vitro-Kulturen von Korallenzellen oder -geweben anwendbar wären, um dieses Phänomen genau zu untersuchen.

Aufgrund der Bedeutung der Korallenriffe und der großen Bedrohungen, denen sie insbesondere in den letzten zwei Jahrzehnten ausgesetzt waren2, sind Korallen weltweit in den Fokus der Forschung für Schutz- und Wiederherstellungszwecke gerückt13. Die Entwicklung von Ansätzen und experimentellen Systemen, die zuverlässig, reproduzierbar und mit minimalen Umweltauswirkungen für die Untersuchung von Korallen sind, ist jedoch ein großer Kampf in diesem Bereich.

Mikrovermehrung ist definiert als die In-vitro-Proliferation des Genotyps eines Organismus durch Kultivierung seines biologischen Materials in kontrollierten Gefäßen14,15. Die Kultivierung von Zellen, Geweben und Organen war in den letzten Jahrzehnten für die Pflanzen- und Tierbiologie von entscheidender Bedeutung. Es ermöglicht die Massenvermehrung von Organismen in Laboratorien, die schnelle Beurteilung verschiedener Behandlungen (wie Medikamente und Pharmazeutika) und die direkte Untersuchung der Zellfunktion14,15,16,17. Im Allgemeinen haben sich In-vitro-Modelle als nützlich erwiesen, um die Studien verschiedener Organismen unter besser kontrollierten physikalischen und chemischen Bedingungen zu ergänzen und zu vertiefen. Aufgrund der Vorteile von In-vitro-Kultivierungstechniken wurden verschiedene Tierzell– und Gewebekulturtechnologien entwickelt, optimiert und als wichtige Werkzeuge in vielen Forschungsbereichen eingesetzt, in denen mehrere Zelllinien für zahlreiche Anwendungen untersucht und kommerzialisiert wurden16,17,18.

Seit der ersten tierischen Gewebekultur im Jahr1882 wurden viele Fortschritte in der Erfassung der Zell- und Gewebekultur erzielt, wie die Verwendung natürlicher und synthetischer Medien, die Erfindung etablierter Zelllinien und die Entwicklung von 3D-Medien, um eine Vielzahl von Zelltypen besser zu kultivieren16,17, 18,19 Das Gebiet der Zellbiologie hat sich jedoch hauptsächlich auf eine ausgewählte Gruppe von Modellorganismen konzentriert, während viele Taxa immer noch keine gut etablierten In-vitro-Kulturen von Zellen, Geweben oder Organenhaben 20. Zum Beispiel wurden in der Korallenforschung keine unsterblichen Zelllinien umfassend für die Forschung verwendet, was die Korallenzellforschung auf die Verwendung von primären Zellkulturen beschränkt. Diese Kulturen haben eine auf einige Wochenbeschränkte Lebensfähigkeit 21, wobei keine Studien das Überleben einzelner Zellen aus allen Korallengeweben für mehr als 13 Tage bis Anfang 2021 aufzeichnen22. Der erste Bericht über nachhaltige Korallenzelllinien, der veröffentlicht wurde, war mit Acropora tenuis-Zellen, die bis zu 6 Monate lebten, und der Nutzen dieser Zellen für zukünftige Forschung muss noch erforschtwerden 23.

Um die Einschränkungen bei der Kultivierung von Korallenzellkulturen zu überwinden und eine Laborkultur aufrechtzuerhalten, die die gesamte Gewebeorganisation von Korallen bewahrt, wurde kürzlich die Verwendung isolierter Polypen als Modell für die korallenbiologische Forschungvorgeschlagen 24,25. Polypen sind die anatomischen Einheiten von Korallen, und jeder von ihnen hat einen Mund in der Mitte ihrer Mundscheibe und ist durch den Coenosarc in seiner Aboralregion mit anderen Polypen verbunden26. Die Trennung lebender Polypen erfolgt auf natürliche Weise durch den Prozess des Polypen-Bail-outs, bei dem akuter Stress die Verdauung des Coenosarcs zwischen den Polypen verursacht, der sich dann vom Skelett der Kolonie lösen kann25,27,28. Es wurde berichtet, dass dieses Phänomen in einer Vielzahl von Taxa auftritt, einschließlich Oktokorallen 29,30,31, schwarzen Korallen 32 und skleraktinischen Korallen 25,27,28,32,33, und wurde mit mehreren Umweltstressoren in Verbindung gebracht, wie z.B. Kalziummangel in Wasser 24,34, erhöhter Säuregehalt 35, hyperosmotische Bedingungen 25,27,32,36, hohe Temperaturen 36,37, Hunger 33, Luftexposition25,30 und Insektizidkontamination 28,38. Polypen-Bail-out wurde zum Beispiel in Pocilloporid-Korallen19 berichtet, die auf der ganzen Welt weit verbreitet sind und häufig als Modelle in der Korallenforschung verwendet werden. Zu dieser Gruppe gehörende Arten wie Pocillopora damicornis und Styllophora pistillata haben aus einem 5-mm-Fragment25 etwa 30-40 Mikrovermehrungsmittel erzeugt. Diese Zahl unterstreicht den Vorteil der Verwendung von Polypen-Bail-out als Methode zur Mikrovermehrung von Korallen, da sie die Möglichkeit schafft, viele genetisch identische Individuen aus einem kleinen Stück Koralle zu erzeugen. Die Verwendung isolierter Polypen für die Forschung hat auch die gleichen Vorteile wie Zellkulturen hinsichtlich der Möglichkeit, in kontrollierten Laborumgebungen wie Kolben und Petrischalen kultiviert zu werden. Darüber hinaus haben mikrofluidische Plattformen zur Aufrechterhaltung lebender Polypen gezeigt, dass diese Mikropropagate in relativ billigen und leicht zu reproduzierenden Umgebungen mit kontrolliertem Wasserdurchfluss, Oberfläche und Temperatur24,25 gehalten werden können. Diese Mikrofluidik-Plattformen können auch verwendet werden, um lebende Korallenstrukturen direkt unter einem Mikroskop zu visualisieren24,25.

Im vorliegenden Artikel fassen wir die Techniken zusammen, die entwickelt wurden, um einzelne Korallenpolypen aus ihren Kolonien zu isolieren, und zeigen, wie sie unter Laborbedingungen für eine langfristige Kultur gehalten werden können. Zu den diskutierten Methoden gehören Polypen-Bail-out durch hyperosmotische Bedingungen durch Verdunstung und Pumpen von Meerwasser mit hohem Salzgehalt und Inkubation in kalziumfreiem Meerwasser.

Protocol

Für die vorliegende Studie wurde eine Kolonie der Korallenart Pocillopora verrucosa vom Al Fahal Riff (22.305118 N; 38.964568 E) durch Tauchen mit Hammer und Meißel gesammelt. Die Gattung der Kolonie wurde morphologisch identifiziert, und ihre Art wurde als P. verrucosa klassifiziert, basierend auf zuvor veröffentlichten Arbeiten, einschließlich Pocillopora aus dem Roten Meer, was darauf hindeutet, dass aus genetischer Sicht die in diesem Gebiet vorkommende Art P. verrucosa39,40 ist. Das Al Fahal-Riff ist nicht Teil eines geschützten Umweltgebiets, und für die Korallensammlung waren keine Sondergenehmigungen erforderlich. Die Kolonie wurde einen Monat lang in einem 300-Liter-Aquarium gehalten, bevor sie fragmentiert wurde und ihre Polypen “gerettet” wurden. Das Aquarium wurde mit zwei Aquarienheizungen, drei Pumpen und zwei Lichtquellen (siehe Materialtabelle) bei 26 °C gehalten, wobei ein Lichtzyklus von 12 Stunden eingehalten wurde. Die Temperatur des Aquariums wurde aufrechterhalten, indem jede der beiden Heizungen an einen Temperaturregler angeschlossen wurde. Die Lichtemission wurde so programmiert, dass sie um 6 Uhr morgens beginnt und um 18 Uhr endet, wodurch eine Bestrahlungsstärkekurve erzeugt wird, die um 12 Uhr mit 230 μmol-Photonen m−2s−1 ihren Höhepunkt erreichte. 1. Polyp-Bail-out durch hohen Salzgehalt nach Wasserverdunstung HINWEIS: Diese Methode wurde von Shapiro et al.25 übernommen. Bei Verwendung anderer Arten als Pocillopora verrucosa sollte die Größe der Polypen berücksichtigt werden, bevor die Größe des zu schneidenden Fragments bestimmt wird. Schneiden Sie kleine Fragmente (weniger als 1 cm lang) aus einer Korallenkolonie mit diagonalen Schneidzangen (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Passen Sie die Schneidwerkzeuge an die verwendete Korallenart an. Diagonale Zangen sind nützlich zum Schneiden von Korallen mit schlanken Zweigen. In der aktuellen Studie wurde für jede Behandlung ein Fragment geschnitten, aber die Anzahl und Größe der Fragmente kann je nach Anzahl der gewünschten Polypen variieren. Die Größe der geschnittenen Fragmente darf die Tiefe des Wassers nach der Verdunstung nicht überschreiten, so dass die Korallen nach dem Prozess vollständig im Wasser bleiben. Legen Sie die geschnittenen Fragmente in kleine Petrischalen gefüllt mit 12 ml Meerwasser, an die sich die Korallenkolonie gewöhnt hat. Dies kann künstliches Meerwasser (siehe Materialtabelle) oder gefiltertes Meerwasser mit dem gleichen Salzgehalt sein, in das die Korallenkolonie vor der Fragmentierung eingeführt wurde.HINWEIS: Es ist wichtig, das Fragment vollständig mit Wasser zu bedecken. Wenn 12 ml in einer Petrischale nicht ausreichen, um das geschnittene Fragment abzudecken, optimieren Sie den Behälter und das Volumen entsprechend. In der vorliegenden Studie wurde das verwendete Wasser aus dem Roten Meer gesammelt, und sein Salzgehalt betrug 40 PSU, gemessen von einem Multiparameter-Messgerät (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie die Platte für ~ 24 h bei Umgebungstemperatur offen, damit das Wasser verdunsten kann und sein Salzgehalt allmählich zunehmen kann. Wenn die Gewebeverdauung zwischen den Polypen beobachtet werden kann, fahren Sie mit Schritt 1.4 fort.HINWEIS: Nach Ablauf der Inkubationszeit muss der Salzgehalt des Wassers etwa 40% höher sein als am Anfang, und die Polypen müssen bereit sein, sich vom Skelett zu lösen. Erzeugen Sie mit einer 1-ml-Transferpipette einen sanften Fluss in der Nähe des Korallengewebes. Der Fluss hilft langsam bei der vollständigen Ablösung der Polypen, die das Gewebe um sie herum bereits vom Skelett verdaut haben.HINWEIS: Wenn der Wasserfluss mit der Pipette erzeugt wird, müssen separate Polypen oder Gruppen von Polypen als Flocken vom Skelett abgehen. Wenn sich stattdessen eine trüben Substanz löst, deutet dies auf den Tod oder Zerfall des Gewebes hin, was bedeutet, dass die Korallen zu lange oder in einem zu stressigen Zustand (in diesem Fall hoher Salzgehalt) inkubiert wurden. Es ist sehr wichtig, einen sanften Wasserfluss zu machen, um die Polypen zu lösen, da ein stärkerer Fluss sie physisch schädigen kann. Tauschen Sie das Wasser in der Petrischale langsam mit isosmotischem Wasser (verwenden Sie dasselbe Wasser wie in Schritt 1.2.) mit einer Pipette aus. Ein Wasseraustausch von 50% über 10 Minuten reicht aus, um die Polypen wieder an einen stressfreien Salzgehalt zu gewöhnen.HINWEIS: Als Korallenkolonien der Pocilloporidenart Pocillopora verrucosa aus dem Roten Meer verwendet wurden, wurden Tests durchgeführt, um festzustellen, unter welchen spezifischen Bedingungen die Korallen aus dieser einzigartigen Umgebung gerettet würden. Es ist wichtig, den hohen Salzgehalt des Roten Meeres im Vergleich zu den meisten anderen Riffumgebungen hervorzuheben. 2. Polyp-Rettung durch Meerwasserversorgung mit hohem Salzgehalt HINWEIS: Diese Methode wurde von Chuang et al.27 übernommen. Bereiten Sie 3 l Meerwasser mit hohem Salzgehalt vor, indem Sie NaCl in das Meerwasser geben, bis der Salzgehalt um 85% ansteigt, gemessen an einer Salzgehaltssonde.HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde aus 40 PSU Meerwasser aus 40 PSU Meerwasser aus dem Roten Meer ein 74 PSU hochsalziges Meerwasser hergestellt. Schneiden Sie kleine Korallenfragmente wie in Schritt 1.1 beschrieben aus. Legen Sie die geschnittenen Fragmente in einen 10-Liter-Behälter, der mit 3 l isosmotischem Meerwasser (in diesem Fall Meerwasser mit einem für die Korallen nicht belastenden Salzgehalt, wie in Schritt 1.2 verwendet) gefüllt ist, das an eine Peristaltikpumpe angeschlossen ist (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Zur besseren Erhaltung der Korallengesundheit können Temperaturregler, Luftpumpen und Lichter hinzugefügt werden, um die gleichen Aquarienbedingungen zu simulieren, denen die Kolonie zuvor ausgesetzt war. Während der Inkubation in der vorliegenden Arbeit wurden die Korallenfragmente in Behältern bei 26 ° C unter einem täglichen Lichtzyklus von 12 h aufbewahrt. Die Wasserbewegung und die Homogenisierung der Temperatur wurden durch Luftpumpen aufrechterhalten. Füllen Sie den Behälter mit Korallenfragmenten mit dem in Schritt 2.1 hergestellten Meerwasser mit hohem Salzgehalt mit der Peristaltikpumpe für 24 h mit einer Rate von 126 ml/h. Fügen Sie insgesamt 3 L Wasser bei einem steigenden Salzgehalt von ca. 40% hinzu.HINWEIS: Wasser mit hohem Salzgehalt kann einfach durch Zugabe von NaCl zum Meerwasser hergestellt werden, bis der beabsichtigte Salzgehalt erreicht ist. Erstellen Sie einen sanften Wasserfluss mit einer Pipette, um die Polypen aus dem Skelett zu lösen (Schritt 1.4.). Tauschen Sie das Wasser, in dem die Polypen enthalten sind, langsam gegen isosmotisches Wasser aus (Schritt 1.5.). Fahren Sie als Nächstes mit Schritt 4 oder Schritt 5 fort. 3. Polyp-Bail-out durch kalziumfreie Meerwasserinkubation HINWEIS: Diese Methode wurde von Pang et al.24 übernommen. Es wird eine kalziumfreie künstliche Meerwasserlösung (CaFSW) hergestellt, indem 26,29 g NaCl, 0,872 g KCl, 2,16 g MgSO4, 11,94 gMgCl2, 3,42 gNa2SO4 und 0,286 gNaHCO 3 (siehe Materialtabelle) zu 1 L entionisiertem Wasser hinzugefügt werden.HINWEIS: Diese Lösung wurde von früheren Protokollen angepasst, um besser für Korallen geeignet zu sein, die an einen Salzgehalt von 40 PSU angepasst sind. Verwenden Sie für Korallen, die an andere Salzgehaltsbedingungen angepasst sind, den gleichen Anteil an Salzen, passen Sie jedoch die Gesamtmasse der gelösten Stoffe an, um den Salzgehalt zu erhalten, der für die verwendeten Korallen besser geeignet ist. Schneiden Sie kleine Korallenfragmente wie in Schritt 1.1 beschrieben aus. Tauchen Sie die Korallenfragmente in Petrischalen ein, die mit dem zuvor vorbereiteten CaFSW gefüllt sind (Schritt 3.1.) und inkubieren Sie sie in Orbitalinkubatoren mit einer Drehzahl von 80 U / min für 3 h.HINWEIS: Auch hier ist es wichtig, das Fragment vollständig mit Wasser zu bedecken. Wenn eine Petrischale nicht ausreicht, um das Fragment abzudecken, optimieren Sie den Behälter und das Volumen entsprechend dem experimentellen Bedarf. Übertragen Sie die Fragmente in Petrischalen oder 6-Well-Teller, die mit 20% Dulbeccos modifizierten Eagle-Medien (DMEM) und 100 mg/ml Ampicillinlösung (siehe Materialtabelle) gefüllt sind, die mit künstlichem Meerwasser mit 40 PSU hergestellt wurden. Inkubieren Sie die Fragmente bei 26 °C und 80 U/min und tauschen Sie die Medien täglich aus, bis die Gewebeverdauung zwischen den Polypen beobachtbar ist und sich einzelne Polypen vom Skelett lösen.HINWEIS: In den meisten Fällen ist die Gewebeverdauung innerhalb von 20 Stunden nach der Inkubation in diesem Medium abgeschlossen, und es ist kein Austausch erforderlich. Übertragen Sie die Polypen zur ersten Rückgewinnung mit einer Pipette in sterilisiertes Meerwasser. Fahren Sie nach 1 Stunde Inkubation mit Schritt 4 oder Schritt 5 fort. 4. Polypenpflege in Petrischalen Sobald die Polypen mit nicht belastendem Salzgehalt in gefiltertes Meerwasser zurückgeführt wurden, wählen Sie lebensfähige Polypen aus, indem Sie die Integrität und Bewegung des Gewebes beobachten, die durch den Ziliarfluss unter einem Stereomikroskop verursacht werden. Legen Sie die ausgewählten Polypen in eine Glas- oder Kunststoff-Petrischale und bedecken Sie die Petrischale mit einem Planktonnetz (200 μm Maschenweite, siehe Materialtabelle), damit die Polypen nicht von der Schale wegschwimmen.HINWEIS: Die Größe des Maschennetzes kann je nach Größe der Polypen variieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die Netze Poren haben müssen, die kleiner als die Polypen sind und Wasseraustausch und Lichtdurchdringung ermöglichen. Stellen Sie die Petrischale in ein Aquarium mit den entsprechenden Bedingungen für die verwendeten Korallenarten.HINWEIS: In der vorliegenden Studie waren die Bedingungen 40 PSU gefiltertes Meerwasser bei 26 °C und ein 12 h Lichtzyklus. Öffnen Sie die Petrischalen mindestens einmal pro Woche, um das Wasser zu erneuern und das Geschirr zu reinigen. Dieser Schritt ist wichtig, um Algenüberwucherung zu beseitigen, die mit den Korallenpolypen konkurrieren oder diese schädigen kann, indem sie lokal toxische Verbindungen freisetzt. 5. Polypenpflege in Inkubatoren Wählen Sie lebensfähige Polypen wie in Schritt 4.1 beschrieben aus. Legen Sie die Polypen in 75 cm 2 Oberflächenzellenkolben, die mit 50 ml isosmotischem Meerwasser gefüllt sind, wobei Transferpipetten verwendet werden.HINWEIS: In der aktuellen Arbeit wurde gefiltertes Meerwasser aus dem Roten Meer für die Polypenpflege verwendet. Es kann Wasser mit den gleichen Eigenschaften wie in Schritt 1.2 verwendet werden. Schließen Sie die Kolben und bringen Sie sie in Brutkästen. Stellen Sie die Inkubatoren auf 12 h Lichtzyklen bei 26 °C und 40 U/min ein. Tauschen Sie alle 4 Tage 50% des Wasservolumens aus und übertragen Sie den Inhalt in saubere Kolben, wenn sie an den Wänden mit Algen oder Biofilm gefüllt sind.HINWEIS: Die Bilder wurden mit einem vollständig apochromatischen Zoomsystem aufgenommen, das mit einer HD-Kamera (siehe Materialtabelle) für die repräsentativen Ergebnisse ausgestattet ist.

Representative Results

Polypen-Bail-out wurde in Korallenfragmenten, die zu einer einzigen Kolonie der Art P. verrucosa gehören, nach drei verschiedenen Methoden induziert (Abbildung 1). Das durch hohen Salzgehalt induzierte Bail-out nach Wasserverdunstung war nach 24 h Inkubation von Korallenfragmenten in Petrischalen bei Umgebungstemperatur, die zunächst mit Wasser gefüllt war, bei 40 PSU abgeschlossen, das dann nach Abschluss des Prozesses einen endgültigen Salzgehalt von 59 PSU erreichte (Abbildung 2A-C, I). Die Rettung durch die Salzwasserversorgung wurde auch nach 24 h Inkubation in Wasser zunächst bei 40 PSU erreicht, die nach 12 h einen Salzgehalt von 52 PSU und am Ende des Prozesses nach 24 h 59 PSU erreichte (Abbildung 2D-F,I). In beiden Experimenten war ein Anstieg des Salzgehalts für die Induktion der Gewebeverdauung durch die Polypen verantwortlich. Nach 12 h verursachte der hohe Salzgehalt die Kontraktion der Polypen in Verbindung mit der allmählichen Ausdünnung des Coenosarc, was schließlich zur endgültigen Ablösung der Polypen nach 24 h führte. Die Bail-out-Induktion durch Inkubation in kalziumfreiem Meerwasser war nach einer 3-stündigen Inkubation in CaFSW mit anschließender 20-stündiger Inkubation in den 20%-DMEM-Medien abgeschlossen (Abbildung 2G-H). Das Gewebe löste sich bei allen drei Methoden vom Skelett, nachdem es mit einer Pipette weggedrückt wurde, bis individualisierte Korallenpolypen (Abbildung 3A-C) und “Gewebekugeln” erzeugt wurden. Nach der Ablösung wurden die Polypen aus allen drei Methoden gesammelt und konnten sich im Meerwasser erholen, bevor sie Petrischalen zugeteilt wurden, die mit Netzen oder Zellkolben bedeckt waren. Die aus der Verdunstung und den Wasserversorgungsmethoden gewonnenen Polypen wurden in Petrischalen in Aquarien gehalten und überlebten 6 Wochen bzw. 8 Wochen (Abbildung 3D und Abbildung 3F). Diese Mikropropagate behielten die übliche Anatomie von Polypen bei und präsentierten Tentakel, Basalscheiben und Münder1. Die Polypen, die durch die Inkubation in kalziumfreiem Meerwasser erhalten wurden, hatten eine kurze Lebensdauer und überlebten bis zu 1 Tag, danach dissoziierte ihr Gewebe. Polypen, die aus der Meerwasserverdampfungsmethode gewonnen wurden, die in Zellkulturflaschen in Inkubatoren aufbewahrt wurden, überlebten bis zu 3 Wochen ohne Dissoziation von Geweben (Abbildung 3F). In allen Fällen, obwohl sich die Polypen nicht an das Substrat anheften konnten, waren sie visuell gesund und behielten ihre Farbe bei, wobei Zooxanthellenzellen in ihren Geweben immer noch sichtbarwaren 1. Abbildung 1: Schematische Darstellung der drei verschiedenen getesteten Methoden für die Polypen-Bail-out-Induktion (links), gefolgt von der Darstellung von zwei Methoden zur Aufrechterhaltung der erworbenen Polypen unter Laborbedingungen (rechts). (A) Darstellung der Methodik für die Polypenrettung durch Wasserverdunstung. (B) Darstellung der Methodik für die Rettung von Polypen durch Meerwasserversorgung mit hohem Salzgehalt. (C) Darstellung der Methodik für die Polypenrettung durch kalziumfreie Meerwasserinkubation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Bilder des Polypen-Bail-out-Prozesses, der durch drei verschiedene Methoden unter Verwendung von Fragmenten der Korallenart P. verrucosa induziert wurde. (A-C) Ein Korallenfragment bei 0 h, 12 h bzw. 24 h nach der Inkubation in einer Petrischale mit der Wasserverdampfungsmethode. (D-F) Ein Korallenfragment bei 0 h, 12 h bzw. 24 h nach der Inkubation unter Verwendung der Meerwasserversorgungsmethode mit hohem Salzgehalt. (G,H) Korallenfragmente, die vor bzw. nach der kalziumfreien Meerwasserinkubationsmethode ausgesetzt waren. Die Inkubationen in kalziumfreiem künstlichem Meerwasser betrugen für 3 h und in 20% DMEM für 21 h. (I) Grafische Darstellung der Salzgehaltswerte in PSU des Meerwassers im Laufe der Zeit während der Wasserverdunstungs- und hochsalzigen Meerwasserversorgungs-Bail-out-Induktionsmethoden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Bilder von P. verrucosa-Polypen, die aus den drei demonstrierten Bail-out-Induktionsverfahren gewonnen wurden. (A-C) Die Bilder der Polypen, die aus den Verdunstungs-, Salzwasserversorgungs- bzw. kalziumfreien Meerwassermethoden gewonnen wurden, wurden unmittelbar nach ihrer Trennung vom Skelett aufgenommen. (D) Das Bild eines Korallenpolypen, das nach der Verdampfungsmethode nach 6 Wochen in einer Petrischale gewonnen wurde. (E) Das Bild eines Korallenpolypen, das aus der Salzwasserversorgungsmethode gewonnen wurde, nachdem er 8 Wochen in einer Petrischale überlebt hatte. (F) Das Bild eines Korallenpolypen, das nach der Verdampfungsmethode nach 3 Wochen in einem Zellkulturkolben erhalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Die Überlebensrate der Polypen nach der Einleitung zu Rettungsprozessen und die Zeit, die für den Abschluss des Prozesses benötigt wird, variieren zwischen den zuvor berichteten Forschungsergebnissen 25,33,41, was möglicherweise durch die verschiedenen experimentellen Ansätze erklärt wird, die in jeder Studie angewendet werden. Zum Beispiel weisen verschiedene Korallenarten oder sogar Korallen derselben Art, die sich jedoch an unterschiedliche Umweltbedingungen gewöhnt haben (z. B. Korallen aus dem Roten Meer), unterschiedliche Schwellenwerte für den Salzgehalt auf. Auch die gewählte Bail-out-Methode und die Labor-/Aquarienbedingungen spielen eine wichtige Rolle bei den Ergebnissen. In einigen Fällen hat die Aufrechterhaltung von Korallenmikropropagaten unter Laborbedingungen die Überlebenszeit von Korallenzellkulturen überschritten, indem sie Monate des Überlebens in Azooxanthellat 3 3,41 und Zooxanthellat25 Korallen erreicht hat. Die Zeit, in der der Polypen-Bail-out-Prozess abgeschlossen ist, variierte auch in verschiedenen Studien, von einigen Stunden2 5,2 7,30 bis zu Wochen35 Inkubation, die dem Stressor ausgesetzt waren, der für die Auslösung der Rettungsaktion verantwortlich ist. Eine weitere Variable, die bei der Untersuchung des Polypen-Bail-outs zu berücksichtigen ist, ist die Erholung der Polypen nach der Exposition gegenüber dem akuten Stress, der ihre Freisetzung ausgelöst hat. Es ist immer noch fraglich, ob Polypen nach der Rettung in einem guten Zustand sind, um als Modelle für das Studium der Korallenbiologie verwendet zu werden. Die Wiederherstellung ihrer Gewebe nach dem Abbau des Coenosarc ist bei der Verwendung dieser Mikropropagate besorgniserregend. Polypen in vielen Studien, einschließlich der vorliegenden, waren jedoch in der Lage, Zooxanthellenzellen in ihren Geweben und äußeren Morphologien mit intakter oral-aboraler Polarisation und Tentakeln Wochen nach der Rettung 25,27,32,36 zu präsentieren. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass freigesetzte Korallenpolypen, die stark salzhaltigem oder erhitztem Meerwasser ausgesetzt waren, nach der Linderung von akutem Stress in der Lage waren, die Expression von Genen, die mit Prozessen wie Apoptose, Proteolyse und Zellteilung in Verbindung stehen, auf ein Niveau zurückzuführen, das denen vor der Rettung ähnelt32,36 und sogar die Expression von Genen im Zusammenhang mit der Gewebeheilungerhöht 36.

In Bezug auf den Unterschied im Überleben zwischen den Methoden ist es wichtig zu betonen, dass diese Zeit zwischen verschiedenen Experimenten variieren kann, auch wenn die gleichen Techniken verwendet werden, und es kann mit der Gesundheit der verwendeten Fragmente und der ordnungsgemäßen Wartung der Polypen nach dem Rettungsprozess zusammenhängen. Im Falle der Rettung durch kalziumfreie Meerwasserinkubation war das Überleben des Polypen auf 1 Tag begrenzt. Daraus kann geschlossen werden, dass die Methode für das Langzeitüberleben der untersuchten Arten nicht gut geeignet ist, oder eine bessere Anpassung der Technik für P. verrucosa Korallen aus dem Roten Meer vorgenommen werden muss. Die berichteten Ergebnisse zeigten, dass eine längere Überlebenszeit mit den Methoden erhalten wurde, die auf dem allmählichen Anstieg des Salzgehalts basierten, wenn die Polypen dem Tropfen von Wasser mit hohem Salzgehalt ausgesetzt waren. Diese Methode kann einen kontrollierteren Anstieg des Salzgehalts als die Verdunstungsmethode liefern, während sie gleichzeitig nicht für einen Anstieg der Konzentration anderer im Meerwasser gefundener Substanzen verantwortlich ist, einschließlich des Stoffwechselabfalls der Koralle, der für den Organismus potenziell toxisch ist. Aus all diesen Gründen wurde diese Methode als sicherere Alternative zur Erhaltung gesunder Polypen27 vorgeschlagen. Obwohl angenommen wurde, dass diese Methode für die Gesundheit von Polypen sicherer ist und Polypen produzieren kann, die länger leben, eine Tatsache, die in dieser aktuellen Veröffentlichung bestätigt wurde, sind zusätzliche Umfragen erforderlich, um sie zu bestätigen. Beide durch hohen Salzgehalt induzierten Bail-out-Experimente zeigten eine vollständige Ablösung von Polypen, nachdem der Salzgehalt in 24 h 59 PSU erreicht hatte. Wenn der Salzgehalt über das Niveau hinaus erhöht wird, auf dem das Bail-out abgeschlossen ist, wird den Polypen ein weiterer Stress verursacht, der ihre Überlebenschancen verringert und sich von der akuten Stressbehandlung erholt. Daher wird nicht empfohlen, die Polypen länger in solchen Salzgehalten zu halten. Bei der Durchführung der Bail-out-Induktionsmethode durch Exposition gegenüber kalziumfreiem Meerwasser wurde aus einer 3-stündigen Inkubation in kalziumfreiem künstlichem Meerwasser eine vollständige Loslösung erhalten, so dass eine weitere Exposition gegenüber diesem Medium ebenfalls nicht empfohlen wird.

Um die Methoden zu untersuchen, die für die Untersuchung von Korallenpolypen in Labor- / In-vitro-Untersuchungen besser geeignet waren, konzentrierte sich diese Studie nur auf drei Verfahren, die fast 24 Stunden dauerten, bis der Rettungsprozess abgeschlossen war, und wurden in Studien verwendet, die die langfristige Aufrechterhaltung von Korallenpolypen aus skleraktinischen Korallen beinhalteten. Andere Methoden, von denen berichtet wurde, dass sie signifikant länger als diese Zeit dauerten, wurden nicht angewendet. Die Ablagerung von Polypen auf einem Substrat wurde in dieser Studie nicht versucht, die sich auf die Herstellung von Polypen konzentrierte, die in verschiedene Umgebungen übertragen oder leicht für Analysen mit Einwegpipetten gesammelt werden konnten. Die Ergebnisse zeigen, dass Polypen der Korallenart P. verrucosa mit assoziierten Zooxanthellenzellen, gesundem Sehstatus und einer erhaltenen groben äußeren anatomischen Struktur bis zu 8 Wochen lang am Leben erhalten wurden, auch ohne Bindung an ein Substrat. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit einigen der in dieser Studie gezeigten Techniken mehr biologische Replikate aus einzelnen Korallenfragmenten erzeugt werden können. Solche biologischen Replikate können in kontrollierten Umgebungen (wie Petrischalen und Zellkolben) aufbewahrt und unter Laborbedingungen für monatelange Experimente aufbewahrt und für verschiedene Zwecke verwendet werden.

Seit den ersten zufälligen Beschreibungen des Polypen-Bail-out42,43 wurden neue Protokolle etabliert, um standardisiertere Methoden zur Induktion der Polypenfreisetzung und Aufrechterhaltung solcher Polypen zu finden, die für zukünftige Forschungsanwendungen verwendet werden können. Dazu gehören die Untersuchung verschiedener Aspekte, die mit der Korallen-Holobiont-Physiologie 44 und den Wirt-Mikrobiom-Interaktionen45 verbunden sind, die molekularen Mechanismen, die an der Korallenbleiche beteiligt sind 5,25 und die Gesundheit, Widerstandsfähigkeit und der Schutz des Korallenholobionten 12,13,46,47 . Darüber hinaus können freigesetzte Korallenpolypen für Anwendungen außerhalb des Forschungsbereichs verwendet werden und wurden als nützlich für die Schaffung von Vermehrungen vorgeschlagen, die sich an ein Substrat anheften und wachsen können, wodurch möglicherweise mehrere Korallenindividuen entstehen, die für Wiederherstellungszwecke verwendet werden können, sobald standardisierte Protokolle für die Rettung weit verbreitet sind28 . Obwohl eingehendere Experimente mit geretteten Polypen durchgeführt werden sollten, um die Methodik zu standardisieren, hat sich gezeigt, dass Polypen-Bail-out ein reproduzierbarer Ansatz ist, der als Werkzeug in der Korallenforschung für verschiedene Zwecke angewendet werden kann.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Adam Barno und Francisca Garcia für ihre Unterstützung bei den Experimenten und der Überwachung der Korallenpolypen. Wir danken auch dem KAUST Coastal & Marine Resources Core Lab für die Unterstützung bei der Aquarienpflege und -infrastruktur. Die Studie wurde gefördert durch das KAUST Förderkennzeichen BAS/1/1095-01-01.

Materials

5560 Conductivity/Temperature Probe YSI 5560 Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter
Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers Ace Hardware 2004083 Used to cut coral fragments
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518 Used in DMEM medium.
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41965-039 Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene Thermo Fisher Scientific FB0875713A Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt Schego 548 Heaters used in aquarium
Leica Application Suite Version 4.2 Leica Microsystems NA Software used for image capture in demonstrative results
Leica IC80 HD Leica Microsystems 12730216 Camera used to take demonstrative results pictures
Leica MDG33 Leica Microsystems 10 450 123 Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures
Leica Z6 APO Leica Microsystems NA Macroscope used to take demonstrative results pictures
Magnesium Chloride Thermo Fisher Scientific 7487-88-9 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Magnesium Sulfate Anhydrous Sigma-Aldrich 7791-18-6 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor Masterflex HV-77602-10 Peristaltic pump head.
Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller Masterflex EW-07557-00 Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft Masterflex HV-96410-16 Tubing for peristaltic pump.
Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO Sigma-Aldrich SLGVR33RS Used to filter artificial sea water.
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface Thermo Fisher Scientific 156499 Flask usually used for cell culture used for polyp culture.
Orbital shaker, Advanced 5000, VWR VWR 444-2916 Shaker used inside incubator.
Percival Incubator – I-22VL Percival NA Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.
Plankton net 200 µm mesh size KC Denmark NA Used for covering petri dishes containing coral polyps.
Potassium Chloride VWR Chemicals 7447-40-7 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
ProQuatro Multiparameter Meter YSI 606950 Used for measuring salinity thoughout the protocol
RADION XR15 G5 PRO Ecotech NA Lights used in aquarium
Red Sea Salt
Premium grade, moderate Alkalinity		 Red Sea NA Used to prepare 40 PSU artifical sea water.
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Sodium Sulfate Anhydrous VWR Chemicals 7757-82-6 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
TRD 112 thermostat Schego NA Thermostat used in aquarium
Turbelle Nanostream 6025 Tunze 6025 000 Pumps used in aquarium
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Cardoso, P. M., Alsaggaf, A. A., Villela, H. M., Peixoto, R. S. Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use. J. Vis. Exp. (182), e63840, doi:10.3791/63840 (2022).
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