Indurre il salvataggio di polipi nelle colonie di corallo per ottenere micropropagati individualizzati per uso sperimentale di laboratorio
Summary
Il salvataggio del polipo è un processo indotto dallo stress acuto, in cui i polipi di corallo digeriscono il tessuto che li collega alla loro colonia e si staccano da esso per vivere come individui. Il presente protocollo descrive come indurre la micropropagazione del corallo mediante salvataggio utilizzando trattamenti di acqua di mare ipersalini o privi di calcio.
Abstract
I coralli sono animali coloniali formati da unità modulari chiamate polipi. I polipi di corallo sono fisiologicamente collegati e collegati dai tessuti. Il fenomeno del salvataggio dei polipi è un processo indotto dallo stress acuto, in cui i polipi di corallo digeriscono il tessuto che li collega al resto della colonia e alla fine si staccano dallo scheletro per continuare a vivere come individui separati. I biologi del corallo hanno riconosciuto il processo di salvataggio dei polipi per anni, ma solo di recente i micropropagati generati da questo processo sono stati riconosciuti come un sistema modello per gli studi di biologia dei coralli. L’uso del salvataggio del polipo può creare un numero elevato di unità clonali da un singolo frammento di corallo. Un altro vantaggio è che singoli polipi o patch di polipi possono essere facilmente visualizzati al microscopio e mantenuti in ambienti a basso costo altamente standardizzati come piastre di Petri, fiaschi e chip microfluidici. Il presente protocollo dimostra metodi riproducibili in grado di indurre la micropropagazione dei coralli e diversi approcci per mantenere in vita i singoli polipi a lungo termine. Questa metodologia è stata in grado di coltivare con successo polipi della specie di corallo Pocillopora verrucosa fino a 8 settimane dopo il salvataggio, mostrando la praticità dell’uso di singoli polipi di corallo per la ricerca sui coralli.
Introduction
I coralli scleractiniani o che costruiscono barriere coralline sono cnidari in grado di formare scheletri carbonatici, creare barriere coralline ed ecosistemi strutturalmente complessi che possono essere trovati da ambienti di acque profonde a poco profonde1. Le barriere coralline tropicali ospitano un’elevata biodiversità e forniscono servizi ecosistemici essenziali, come la protezione costiera e la manutenzione della pesca2. La maggior parte dei coralli che costruiscono barriere coralline di acque poco profonde si basano su una relazione mutualistica con le alghe della famiglia delle Symbiodiniaceae, che forniscono l’energia di cui i coralli hanno bisogno per costruire i loro scheletri. La simbiosi tra il corallo e le alghe può essere interrotta dallo stress ambientale, causando lo sbiancamento dei coralli 3,4,5,6. Recenti anomalie di temperatura hanno causato importanti eventi di sbiancamento dei coralli in tutto il mondo, portando alla mortalità di massa dei coralli e al degrado permanente della barriera corallina 7,8,9,10,11. Poiché questo fenomeno si basa sull’espulsione di simbionti da parte di meccanismi cellulari associati allo stress post-calore, come l’apoptosi, l’autofagia e l’esocitosi, lo sbiancamento dei coralli può essere descritto come un processo cellulare che ha conseguenze su scala ecosistemica 5,6,12, il che significa che avere colture in vitro di cellule o tessuti di corallo sarebbe applicabile per studiare da vicino questo fenomeno.
A causa dell’importanza delle barriere coralline e delle principali minacce che hanno dovuto affrontare, in particolare negli ultimi due decenni2, i coralli sono diventati il fulcro della ricerca per scopi di protezione e ripristino in tutto il mondo13. Tuttavia, lo sviluppo di approcci e sistemi sperimentali che siano affidabili, riproducibili e offrano un impatto ambientale minimo per studiare i coralli è una grande lotta in questo campo.
La micropropagazione è definita come la proliferazione in vitro del genotipo di un organismo coltivando il suo materiale biologico in vasi controllati14,15. La coltura di cellule, tessuti e organi è stata cruciale per la biologia vegetale e animale negli ultimi decenni. Permette la riproduzione di massa di organismi in laboratorio, la rapida valutazione di diversi trattamenti (come farmaci e prodotti farmaceutici), e lo studio diretto della funzione cellulare 14,15,16,17. In generale, i modelli in vitro sono stati utili per integrare e approfondire gli studi di diversi organismi in condizioni fisiche e chimiche meglio controllate. A causa dei vantaggi delle tecniche di coltivazione in vitro, sono state sviluppate, ottimizzate e utilizzate diverse tecnologie di coltura di cellule e tessuti animali come strumenti importanti in molti campi di ricerca, dove sono state studiate e commercializzate più linee cellulari per numerose applicazioni 16,17,18.
Molti progressi nella conoscenza della coltura cellulare e tissutale sono stati fatti dalla prima coltura di tessuti animali nel 188217, come l’uso di mezzi naturali e sintetici, l’invenzione di linee cellulari consolidate e lo sviluppo di mezzi 3D per coltivare una moltitudine di tipi di cellule in modo migliore16,17, 18,19. Tuttavia, il campo della biologia cellulare si è concentrato principalmente su un gruppo selezionato di organismi modello, mentre molti taxa non hanno ancora colture in vitro ben consolidate di cellule, tessuti o organi20. Ad esempio, nella ricerca sui coralli, nessuna linea cellulare immortalizzata è stata ampiamente utilizzata per la ricerca, vincolando la ricerca sulle cellule di corallo all’uso di colture cellulari primarie. Queste colture hanno vitalità limitata a poche settimane21, senza studi che registrano la sopravvivenza di singole cellule da tutti i tessuti di corallo per più di 13 giorni fino all’inizio del 202122. Il primo rapporto sulle linee cellulari di corallo sostenibili ad essere pubblicato è stato con cellule di Acropora tenuis che hanno vissuto fino a 6 mesi, e l’utilità di queste cellule per la ricerca futura rimane da esplorare23.
Per superare i limiti nella coltivazione di colture cellulari di corallo e per mantenere una coltura di laboratorio che preservi l’organizzazione tissutale complessiva dei coralli, l’uso di polipi isolati è stato recentemente proposto come modello per la ricerca sulla biologia dei coralli24,25. I polipi sono le unità anatomiche dei coralli e ognuno di essi ha una bocca situata al centro del loro disco orale ed è collegato ad altri polipi dal cenosarco nella sua regione aborigena26. La separazione dei polipi vivi avviene naturalmente attraverso il processo di salvataggio dei polipi, in cui lo stress acuto provoca la digestione del cenosarco tra i polipi, che può quindi staccarsi dallo scheletro della colonia 25,27,28. Questo fenomeno è stato segnalato per verificarsi in una varietà di taxa, tra cui octocoralli29,30,31, coralli neri32 e coralli scleractini 25,27,28,32,33, ed è stato collegato a molteplici fattori di stress ambientali, come la mancanza di calcio nell’acqua 24,34, l’aumento dell’acidità35, condizioni iperosmotiche 25,27,32,36, alte temperature36,37, fame 33, esposizione all’aria25,30 e contaminazione da insetticidi28,38. Il salvataggio di polipi è stato, ad esempio, riportato nei coralli pocilloporidi19, che sono ampiamente distribuiti in tutto il mondo e sono comunemente usati come modelli nella ricerca sui coralli. Specie appartenenti a questo gruppo, come Pocillopora damicornis e Styllophora pistillata, hanno generato circa 30-40 micropropaghi da un frammento di 5 mm25. Questo numero sottolinea il vantaggio di utilizzare il salvataggio del polipo come metodo per la micropropagazione del corallo, in quanto crea la possibilità di generare molti individui geneticamente identici da un piccolo pezzo di corallo. L’uso di polipi isolati per la ricerca ha anche gli stessi vantaggi delle colture cellulari per quanto riguarda la possibilità di essere coltivati in ambienti di laboratorio controllati, come fiaschi e piastre di Petri. Inoltre, le piattaforme microfluidiche per mantenere polipi vivi hanno dimostrato che questi micropropagati possono essere conservati in ambienti relativamente economici e facili da riprodurre, con flusso d’acqua controllato, superficie e temperatura 24,25. Queste piattaforme di microfluidica possono anche essere utilizzate per visualizzare le strutture di coralli vivi al microscopio direttamente24,25.
Nel presente articolo, riassumiamo e dimostriamo le tecniche che sono state sviluppate per isolare i singoli polipi di corallo dalle loro colonie, mostrando come mantenerli in condizioni di laboratorio per la coltura a lungo termine. I metodi discussi includono il salvataggio del polipo attraverso condizioni iperosmotiche per evaporazione e pompaggio di acqua di mare ad alta salinità e incubazione in acqua di mare priva di calcio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il tasso di sopravvivenza dei polipi dopo essere stato sottoposto a processi di salvataggio e il tempo necessario per il completamento del processo variano trale ricerche precedentemente riportate 25,33,41, il che è probabilmente spiegato dai diversi approcci sperimentali applicati in ogni studio. Ad esempio, diverse specie di coralli, o anche coralli della stessa specie ma acclimatati a diverse condizioni ambientali (ad esempio, coralli del Mar Rosso), presentano soglie diverse ai livelli di salinità. Anche il metodo di salvataggio selezionato e le condizioni di laboratorio/ acquario svolgono un ruolo importante nei risultati. In alcuni casi, il mantenimento dei micropropaghi di corallo in condizioni di laboratorio ha superato il tempo di sopravvivenza delle colture cellulari di corallo raggiungendo mesi di sopravvivenza in azooxanthellato3 3,41 e zooxantelato25 coralli. Il tempo per il completamento del processo di salvataggio del polipo è variato anche in diversi studi, che vanno da poche ore2 5,2 7,30 a settimane35 di incubazione esposte al fattore di stress responsabile di causare il salvataggio. Un’altra variabile da tenere in considerazione quando si studia il salvataggio dei polipi è il recupero dei polipi dopo l’esposizione allo stress acuto che ne ha innescato il rilascio. È ancora discutibile se i polipi dopo il salvataggio siano in condizioni abbastanza buone da essere utilizzati come modelli per studiare la biologia dei coralli. Il recupero dei loro tessuti dopo la degradazione del cenosarco è motivo di preoccupazione quando si utilizzano questi micropropaghi. Tuttavia, i polipi in molti studi, incluso il presente, sono stati in grado di presentare cellule di zooxantelle all’interno dei loro tessuti e morfologie esterne con polarizzazione orale-aborigena intatta e tentacoli settimane dopo il salvataggio 25,27,32,36. Studi precedenti hanno anche scoperto che, dopo essere stati sollevati dallo stress acuto, i polipi di corallo rilasciati esposti ad acqua di mare altamente salina o riscaldata sono stati in grado di recuperare l’espressione di geni legati a processi come l’apoptosi, la proteolisi e la divisione cellulare a livelli simili a quelli trovati prima del salvataggio32,36 e persino di aumentare l’espressione di geni legati alla guarigione dei tessuti36.
Per quanto riguarda la differenza di sopravvivenza tra i metodi, è importante evidenziare che questo tempo può variare tra diversi esperimenti anche se vengono utilizzate le stesse tecniche, e può essere correlato alla salute dei frammenti utilizzati e al corretto mantenimento dei polipi dopo il processo di salvataggio. Nel caso del salvataggio attraverso l’incubazione di acqua di mare priva di calcio, la sopravvivenza del polipo è stata limitata a 1 giorno. Pertanto, si può concludere che il metodo non è adatto per la sopravvivenza a lungo termine delle specie studiate, o deve essere fatto un migliore adattamento della tecnica per i coralli P. verrucosa del Mar Rosso. I risultati riportati hanno mostrato che un tempo di sopravvivenza più lungo è stato ottenuto con i metodi basati sul graduale aumento della salinità, quando i polipi sono stati sottoposti al gocciolamento di acqua ad alta salinità. Questo metodo può fornire un aumento più controllato della salinità rispetto al metodo di evaporazione, non essendo allo stesso tempo responsabile di un aumento della concentrazione di altre sostanze presenti nell’acqua di mare, compresi i rifiuti metabolici del corallo, che sono potenzialmente tossici per l’organismo. Per tutti questi motivi, questo metodo è stato suggerito come alternativa più sicura per mantenere polipisani 27. Sebbene questo metodo sia stato ipotizzato per essere più sicuro per la salute dei polipi e in grado di produrre polipi che vivono più a lungo, un fatto che è stato confermato in questa pubblicazione attuale, sono necessari ulteriori sondaggi per confermarlo. Entrambi gli esperimenti di salvataggio indotti da salinità elevata hanno dimostrato un completo distacco di polipi dopo che la salinità ha raggiunto 59 PSU in 24 ore. Se la salinità viene aumentata oltre il livello al quale il salvataggio è completo, ulteriore stress sarà causato ai polipi, riducendo le loro possibilità di sopravvivere e riprendersi dal trattamento dello stress acuto. Pertanto, non è consigliabile mantenere i polipi più a lungo in tali livelli di salinità. Quando si esegue il metodo di induzione del salvataggio mediante esposizione ad acqua di mare priva di calcio, è stato ottenuto un distacco completo da un’incubazione di 3 ore in acqua di mare artificiale priva di calcio, il che significa che anche un’ulteriore esposizione a questo mezzo non è raccomandata.
Per affrontare i metodi che erano più adeguati per lo studio dei polipi di corallo in indagini di laboratorio / in vitro , questo studio si è concentrato solo su tre procedure che hanno richiesto quasi 24 ore per il completamento del processo di salvataggio e sono state utilizzate in studi che hanno coinvolto il mantenimento a lungo termine dei polipi di corallo da coralli scleractiniani. Altri metodi segnalati per richiedere molto più tempo di questo tempo non sono stati impegnati. L’insediamento di polipi su un substrato non è stato tentato in questo studio, che si è concentrato sulla produzione di polipi che potrebbero essere trasferiti in ambienti diversi o facilmente raccolti per le analisi utilizzando pipette usa e getta. I risultati dimostrano che i polipi della specie di corallo P. verrucosa sono stati mantenuti in vita, con cellule zooxantelle associate, stato visivo sano e una struttura anatomica esterna grossolana conservata, fino a 8 settimane, anche senza attaccamento a un substrato. Questi risultati indicano che più repliche biologiche possono essere generate da singoli frammenti di corallo utilizzando alcune delle tecniche dimostrate in questo studio. Tali repliche biologiche possono essere conservate in ambienti controllati (come piastre di Petri e fiaschi cellulari) e mantenute in condizioni di laboratorio per esperimenti di un mese e utilizzate per diversi scopi.
Dalle prime descrizioni incidentali del salvataggio dei polipi 42,43, sono stati stabiliti nuovi protocolli per trovare metodi più standardizzati per indurre il rilascio di polipi e mantenere vivi tali polipi, che possono essere utilizzati per future applicazioni di ricerca. Questi includono lo studio di diversi aspetti associati alla fisiologia dell’olobionte del corallo44 e alle interazioni ospite-microbioma45, i meccanismi molecolari coinvolti nello sbiancamento dei coralli 5,25 e la salute, la resilienza e la protezione dell’olobionte del corallo 12,13,46,47 . Inoltre, i polipi di corallo rilasciati possono essere utilizzati per applicazioni al di fuori del regno della ricerca e sono stati suggeriti utili per creare propaguli che possono attaccarsi a un substrato e crescere, creando potenzialmente più individui di corallo che possono essere utilizzati per scopi di restauro una volta che i protocolli standardizzati per il salvataggio diventano diffusi28 . Nel complesso, sebbene dovrebbero essere eseguiti esperimenti più approfonditi utilizzando polipi salvati per standardizzare la metodologia, è stato dimostrato che il salvataggio dei polipi è un approccio riproducibile che può essere applicato come strumento nella ricerca sui coralli per diversi scopi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Adam Barno e Francisca Garcia per il loro supporto negli esperimenti e nel monitoraggio dei polipi corallini. Ringraziamo anche il KAUST Coastal & Marine Resources Core Lab per la loro assistenza per quanto riguarda la manutenzione e l’infrastruttura dell’acquario. Lo studio è stato finanziato dal numero di sovvenzione KAUST BAS/1/1095-01-01.
Materials
| 5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
| Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
| Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
| Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
| Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
| Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
| Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
| Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
| Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
| Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
| Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
| Percival Incubator – I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
| Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
| Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
| RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
| Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
| Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |
References
- Goffredo, S., Dubinsky, Z. . The Cnidaria, Past, Present and Future: The World of Medusa and her Sisters. , (2016).
- Knowlton, N., et al. Rebuilding coral reefs: a decadal grand challenge. International Coral Reef Society and Future Earth Coasts. , 56 (2021).
- Brown, B. Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs. 16 (1), 129-138 (1997).
- Douglas, A. Coral bleaching–how and why. Marine Pollution Bulletin. 46 (4), 385-392 (2003).
- Nielsen, D. A., Petrou, K., Gates, R. D. Coral bleaching from a single cell perspective. The ISME Journal. 12 (6), 1558-1567 (2018).
- Oakley, C. A., Davy, S. K. . Coral Bleaching: Patterns, Processes, Causes and Consequences. Coral Bleaching Book. , 189-211 (2018).
- Donner, S. D., Heron, S. F., Skirving, W. J. Future scenarios: a review of modelling efforts to predict the future of coral reefs in an era of climate change. Coral Bleaching. , 159-173 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world’s coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Hughes, T. P., et al. Global warming impairs stock-recruitment dynamics of corals. Nature. 568 (7752), 387-390 (2019).
- Moore, J. A., et al. Unprecedented mass bleaching and loss of coral across 12 of latitude in Western Australia in 2010-11. PLoS One. 7 (12), 51807 (2012).
- Duarte, G. A., et al. Heat waves are a major threat to turbid coral reefs in Brazil. Frontiers in Marine Science. 7, 179 (2020).
- Santoro, E. P., et al. Coral microbiome manipulation elicits metabolic and genetic restructuring to mitigate heat stress and evade mortality. Science Advances. 7 (33), (2021).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Debergh, P. C., Read, P. E. . Micropropagation. 1, 1-13 (1991).
- Nitish, K., Reddy, M. P. In vitro plant propagation: a review. Journal of Forest and Environmental Science. 27 (2), 61-72 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Yao, T., Asayama, Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reproductive Medicine and Biology. 16 (2), 99-117 (2017).
- Merten, O. W. Introduction to animal cell culture technology-past, present and future. Cytotechnology. 50 (1-3), 1 (2006).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. P. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
- Lecointe, A., et al. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps. Cytotechnology. 65 (5), 705-724 (2013).
- Nowotny, J. D., Connelly, M. T., Traylor-Knowles, N. Novel methods to establish whole-body primary cell cultures for the cnidarians Nematostella vectensis and Pocillopora damicornis. Scientific Reports. 11 (1), 1-9 (2021).
- Kawamura, K., Nishitsuji, K., Shoguchi, E., Fujiwara, S., Satoh, N. Establishing sustainable cell lines of a coral, Acropora tenuis. Marine Biotechnology. 23, 373-388 (2021).
- Pang, A. -. P., Luo, Y., He, C., Lu, Z., Lu, X. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
- Shapiro, O. H., Kramarsky-Winter, E., Gavish, A. R., Stocker, R., Vardi, A. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Tambutté, S., et al. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 408 (1-2), 58-78 (2011).
- Chuang, P. -. S., Mitarai, S. Signaling pathways in the coral polyp bail-out response. Coral Reefs. 39 (6), 1535-1548 (2020).
- Schweinsberg, M., Gösser, F., Tollrian, R. The history, biological relevance, and potential applications for polyp bail-out in corals. Ecology and Evolution. 11 (13), 8424-8440 (2021).
- Rakka, M., et al. First description of polyp bail-out in cold-water octocorals under aquaria maintenance. Coral Reefs. 38 (1), 15-20 (2019).
- Wells, C. D., Tonra, K. J. Polyp bail-out and reattachment of the abundant Caribbean octocoral Eunicea flexuosa. Coral Reefs. 40 (1), 27-30 (2021).
- Coppari, M., et al. Unveiling asexual reproductive traits in black corals: polyp bail-out in Antipathella subpinnata. Coral Reefs. 39 (6), 1517-1523 (2020).
- Chuang, P. S., Ishikawa, K., Mitarai, S. Morphological and genetic recovery of coral polyps after bail-out. Frontiers in Marine Science. 8, 280 (2021).
- Serrano, E., Coma, R., Inostroza, K., Serrano, O. Polyp bail-out by the coral Astroides calycularis (Scleractinia, Dendrophylliidae). Marine Biodiversity. 48 (3), 1661-1665 (2018).
- Kopecky, E. J., Ostrander, G. K. Isolation and primary culture of viable multicellular endothelial isolates from hard corals. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 35 (10), 616-624 (1999).
- Kvitt, H., et al. Breakdown of coral colonial form under reduced pH conditions is initiated in polyps and mediated through apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2082-2086 (2015).
- Gösser, F., Raulf, A., Mosig, A., Tollrian, R., Schweinsberg, M. Signaling pathways of heat-and hypersalinity-induced polyp bail-out in Pocillopora acuta. Coral Reefs. 40 (6), 1713-1728 (2021).
- Fordyce, A. J., Camp, E. F., Ainsworth, T. D. Polyp bail-out in Pocillopora damicornis following thermal stress. F1000Research. 6, 687 (2017).
- Wecker, P., et al. Exposure to the environmentally-persistent insecticide chlordecone induces detoxification genes and causes polyp bail-out in the coral P. Damicornis. Chemosphere. 195, 190-200 (2018).
- Schmidt-Roach, S., Miller, K. J., Lundgren, P., Andreakis, N. With eyes wide open: a revision of species within and closely related to the Pocillopora damicornis species complex (Scleractinia; Pocilloporidae) using morphology and genetics. Zoological Journal of the Linnean Society. 170 (1), 1-33 (2014).
- Gélin, P., Postaire, B., Fauvelot, C., Magalon, H. Reevaluating species number, distribution and endemism of the coral genus Pocillopora Lamarck, 1816 using species delimitation methods and microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 430-446 (2017).
- Capel, K. C. C., Migotto, A., Zilberberg, C., Kitahara, M. V. Another tool towards invasion? Polyp "bail-out" in Tubastraea coccinea. Coral Reefs. 33 (4), 1165 (2014).
- Kawaguti, S. Materials for the study of reef-building corals III. Science of the South Sea (Kagaku Nanyo). 5, 95-106 (1942).
- Goreau, T. F., Goreau, N. I. The physiology of skeleton formation in corals. II. Calcium deposition by hermatypic corals under various conditions in the reef. Biological Bulletin. 117, 239-250 (1959).
- Swain, T. D., et al. Physiological integration of coral colonies is correlated with bleaching resistance. Marine Ecology Progress Series. 586, 1-10 (2018).
- Sweet, M., et al. Insights into the cultured bacterial fraction of corals. mSystems. 6 (3), 01249 (2020).
- Peixoto, R. S., Rosado, P. M., Leite, D. C. d. A., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial microorganisms for corals (BMC): proposed mechanisms for coral health and resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
- Peixoto, R. S., et al. Coral probiotics: premise, promise, prospects. Annual Review of Animal Biosciences. 9, 265-288 (2021).
