Summary

Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

Published: April 01, 2022
doi:

Summary

El protocolo presenta un método para aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de embriones de ratón disecados o células mesenquimas palatales embrionarias de ratón cultivadas y realizar posterior western blotting para evaluar los niveles de proteína fosforilada.

Abstract

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. Estos cambios morfológicos se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Aquí, se proporcionan dos ejemplos de contextos fisiológicamente relevantes en los que estudiar la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: procesos faciales de ratón, en particular procesos maxilares E11.5, y células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de estantes palatinos secundarios E13.5. Para superar la barrera común de la desfosforilación durante el aislamiento de proteínas, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de fosfoproteínas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las fosfoproteínas después de la eliminación occidental de lisados de proteínas de células enteras. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias fosfoproteínas activas durante el desarrollo craneofacial.

Introduction

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. En el ratón, este proceso comienza en el día embrionario (E) 9.5 con la formación de la prominencia frontonasal y pares de procesos maxilares y mandibulares, cada uno de los cuales contiene células de la cresta neural craneal post-migratorias. Los procesos nasales laterales y mediales surgen de la prominencia frontonasal con la aparición de las fosas nasales y eventualmente se fusionan para formar las fosas nasales. Además, los procesos nasales mediales y los procesos maxilares se fusionan para generar el labio superior. Al mismo tiempo, la palatogénesis se inicia con la formación de distintas excrecencias, los estantes palatinos secundarios, desde el lado oral de los procesos maxilares en E11.5. Con el tiempo, los estantes palatinos crecen hacia abajo a ambos lados de la lengua, se elevan a una posición opuesta por encima de la lengua y, finalmente, se fusionan en la línea media para formar un paladar continuo que separa las cavidades nasales y orales por E16.51.

Estos cambios morfológicos a lo largo del desarrollo craneofacial se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Por ejemplo, los receptores de la membrana celular, como las subfamilias de receptores β del factor de crecimiento transformador (TGF), incluidos los receptores de proteínas morfogenéticas óseas (BMPR) y varias familias de receptores tirosina quinasa (RTK), se autofosforilan al unirse y activarse en las células de la cresta neural craneal 2,3,4 . Además, el receptor transmembrana acoplado a la proteína G Smoothened se fosforila en las células de la cresta neural craneal y el ectodermo craneofacial aguas abajo del ligando Sonic Hedgehog (SHH) que se une al receptor Patched1, lo que resulta en una acumulación suavizada en la membrana ciliar y la activación de la vía SHH5. Tales interacciones ligando-receptor pueden ocurrir a través de la señalización autocrina, paracrina y / o yuxtacrina en contextos craneofaciales. Por ejemplo, se sabe que BMP6 señala de manera autocrina durante la diferenciación de condrocitos6, mientras que el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 8 se expresa en el ectodermo del arco faríngeo y se une a los miembros de la familia FGF de RTK expresados en el mesénquima del arco faríngeo de manera paracrina para iniciar el modelado y el crecimiento de los arcos faríngeos7, 8,9,10. Además, la señalización de Notch se activa tanto en condrocitos como en osteoblastos durante el desarrollo esquelético craneofacial a través de la señalización de yuxtacrina cuando los ligandos Transmembrana Delta y/o Jagged se unen a los receptores de Notch transmembrana en las células vecinas, que posteriormente se escindieron y fosforilan11. Sin embargo, hay otros pares de ligandos y receptores importantes para el desarrollo craneofacial que tienen la flexibilidad para funcionar tanto en la señalización autocrina como en la paracrina. Como ejemplo, durante la morfogénesis de los dientes murinos, se ha demostrado que el ligando del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AA indica de manera autocrina para activar el RTK PDGFRα en el epitelio12 del órgano del esmalte. Por el contrario, en los procesos faciales murinos durante la mitad de la gestación, las transcripciones que codifican los ligandos PDGF-AA y PDGF-CC se expresan en el ectodermo craneofacial, mientras que el receptor PDGFRα se expresa en el mesénquima subyacente derivado de la cresta neural craneal, lo que resulta en una señalización paracrina 13,14,15,16,17 . Independientemente del mecanismo de señalización, estos eventos de fosforilación del receptor a menudo resultan en el reclutamiento de proteínas adaptadoras y / o moléculas de señalización, que con frecuencia se fosforilan para iniciar cascadas de quinasa intracelular, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)18,19.

Los efectores intracelulares terminales de estas cascadas pueden fosforilar una serie de sustratos, como factores de transcripción, unión a ARN, proteínas citoesqueléticas y de matriz extracelular. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 y Sox9 26 se encuentran entre los factores de transcripción fosforilados en el contexto del desarrollo craneofacial. Esta modificación post-traduccional (PTM) puede afectar directamente la susceptibilidad a ptM alternativos, dimerización, estabilidad, escisión y/o afinidad de unión al ADN, entre otras actividades 20,21,25,26. Además, la proteína de unión al ARN Srsf3 se fosforila en el contexto del desarrollo craneofacial, lo que lleva a su translocación nuclear27. En general, se ha demostrado que la fosforilación de las proteínas de unión al ARN afecta su localización subcelular, las interacciones proteína-proteína, la unión al ARN y/o la especificidad de la secuencia28. Además, la fosforilación de la actomiosina puede conducir a reordenamientos citoesqueléticos a lo largo del desarrollo craneofacial29,30, y la fosforilación de proteínas de la matriz extracelular, como las pequeñas glicoproteínas ligadas al ligando a la ligando a integrinas N, contribuye a la biomineralización durante el desarrollo esquelético31. A través de lo anterior y muchos otros ejemplos, es evidente que hay amplias implicaciones para la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial. Añadiendo un nivel adicional de regulación, la fosforilación de proteínas es modulada aún más por las fosfatasas, que contrarrestan las quinasas mediante la eliminación de grupos fosfato.

Estos eventos de fosforilación tanto a nivel de molécula receptora como efectora son críticos para la propagación de las vías de señalización y, en última instancia, dan lugar a cambios en la expresión génica en el núcleo, impulsando actividades celulares específicas, como la migración, la proliferación, la supervivencia y la diferenciación, que resultan en la formación adecuada de la cara del mamífero. Dada la especificidad del contexto de las interacciones de las proteínas con las quinasas y las fosfatasas, los cambios resultantes en los PTM y sus efectos sobre la actividad celular, es fundamental que estos parámetros se estudien en un entorno fisiológicamente relevante para obtener una comprensión completa de la contribución de los eventos de fosforilación al desarrollo craneofacial. Aquí, se proporcionan ejemplos de dos contextos en los que estudiar la fosforilación de proteínas y, por lo tanto, la activación de las vías de señalización durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: los procesos faciales de ratón, en particular los procesos maxilares E11.5, y las células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de E13.5 estantes palatinos secundarios, tanto primarios32 como inmortalizados33 . En E11.5, los procesos maxilares están en proceso de fusión con los procesos nasales laterales y mediales1, lo que representa un punto de tiempo crítico durante el desarrollo craneofacial del ratón. Además, los procesos maxilares y las células derivadas de los estantes palatinos se eligieron aquí porque las últimas estructuras son derivadas de las primeras, lo que brinda a los investigadores la oportunidad de interrogar la fosforilación de proteínas in vivo e in vitro en contextos relacionados. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a procesos faciales alternativos y puntos de tiempo de desarrollo.

Un problema crítico en el estudio de las proteínas fosforiladas es que son fácilmente desfosforiladas durante el aislamiento de proteínas por abundantes fosfatasas ambientales. Para superar esta barrera, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de proteínas fosforiladas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las proteínas fosforiladas. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias vías de señalización activas durante el desarrollo craneofacial.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado y se realizaron de conformidad con las pautas y regulaciones institucionales. Se utilizaron ratones hembra 129S4 a los 1,5-6 meses de edad y alojados a una temperatura subteronetral de 21-23 °C para la recolección de embriones. Un flujo de trabajo esquemático del protocolo se representa en la Figura 1….

Representative Results

Al intentar caracterizar la fosforilación de proteínas aisladas de procesos faciales de ratón y/o células mesenquimas palatales cultivadas, los resultados representativos idealmente revelarán una banda distinta y reproducible después de Western Blotting con un anticuerpo antifosfoproteína que corre a la altura o cerca de la altura de la banda de proteína total correspondiente (Figura 3 ). Sin embargo, si se produce una fosforilación extensa de la proteína, puede haber un ligero des…

Discussion

El protocolo descrito aquí permite a los investigadores sondear eventos críticos de señalización dependientes de la fosforilación durante el desarrollo craneofacial de una manera robusta y reproducible. Hay varios pasos críticos en este protocolo que aseguran la recopilación adecuada de datos y el análisis de los resultados. Ya sea aislando fosfoproteínas de procesos faciales de ratón y / o células mesenquimas palatales cultivadas, es imperativo moverse de manera rápida y eficiente mientras se mantienen todos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los ratones 129S4 fueron un regalo del Dr. Philippe Soriano, de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Este trabajo fue apoyado con fondos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH)/Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) R01 DE027689 y K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. y F31 DE029364 a B.J.C.D.

Materials

Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca – 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , (2022).
  36. . Analyzing gels and western blots with ImageJ Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010)
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

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Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

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