Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. No camundongo, esse processo começa no dia embrionário (E) 9.5 com a formação da proeminência frontonasal e pares de processos maxilares e mandibulares, cada um dos quais contém células de crista neural craniana pós-migratória. Os processos nasais laterais e mediais surgem do destaque frontonasal com o aparecimento das covas nasais e eventualmente se fundem para formar as narinas. Além disso, os processos nasais medial e processos maxilarários se fundem para gerar o lábio superior. Simultaneamente, a palatogênese é iniciada com a formação de crescimentos distintos – as prateleiras palatais secundárias – do lado oral dos processos maxilares em E11,5. Com o tempo, as prateleiras palatais crescem para baixo em ambos os lados da língua, elevam para uma posição oposta acima da língua, e eventualmente se fundem na linha média para formar um paladar contínuo que separa as cavidades nasais e orais por E16,5¹.

Essas alterações morfológicas ao longo do desenvolvimento craniofacial são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Por exemplo, receptores de membrana celular, como subfamílias de fator de crescimento transformador (TGF)-β receptores, incluindo receptores de proteína morfogenética óssea (BMPRs), e várias famílias receptoras de tyrosina quinase (RTK), são autofosforilados sobre ligação de ligante e ativação em células de crista neural craniana ^2,3,4 . Além disso, o receptor de transmembrano acoplado à proteína G Smoothened torna-se fosforilado em células de crista neural craniana e ectoderme craniofacial a jusante do ligante de ouriço Sonic (SHH) ligado ao receptor Patched1, resultando em acúmulo de liso na membrana ciliar e ativação da via SHH⁵. Tais interações ligantes-receptor podem ocorrer através de sinalização autocrina, paracrina e/ou justacrina em contextos craniofaciais. Por exemplo, BMP6 é conhecido por sinalizar de forma autocririna durante a diferenciação de condrocito⁶, enquanto o fator de crescimento do fibroblasto (FGF) 8 é expresso no arco faringeal e se liga aos membros da família FGF de RTKs expressas no arco faringeal mesenchyme de forma paracrina para o início do padrão e crescimento do arco faringeal^{7, 8,9,10}. Além disso, a sinalização de Entalhe é ativada em condrócitos e osteoblastos durante o desenvolvimento esquelético craniofacial através da sinalização justacririna quando os ligantes delta e/ou irregulares se ligam aos receptores de notch transmembrano em células vizinhas, que são posteriormente cortados e fosfoilados¹¹. No entanto, existem outros pares de ligantes e receptores importantes para o desenvolvimento craniofacial que têm a flexibilidade de funcionar tanto na sinalização autocrina quanto na paracrina. Como exemplo, durante a morgênese dentária murina, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)-AA foi demonstrado para sinalizar de forma autocrina para ativar o RTK PDGFRα no epitélio do órgão de esmalte¹². Em contraste, nos processos faciais murinos durante a gestação média, as transcrições que codificam os ligantes PDGF-AA e PDGF-CC são expressas no ectoderme craniofacial, enquanto o receptor PDGFRα é expresso no mesenchyme craniano-derivado, resultando em sinalização paracrina 13,14,15, ^16,17 . Independentemente do mecanismo de sinalização, esses eventos de fosforilação receptora frequentemente resultam no recrutamento de proteínas adaptadoras e/ou moléculas de sinalização, que frequentemente se tornam fosforilatos para iniciar cascatas de quinase intracelular, como a via de quinase de proteína ativada por mitogênio (MAPK)^18,19.

Os efeitos intracelulares terminais dessas cascatas podem então fosforilarar uma matriz de substratos, como fatores de transcrição, RNA-binding, citoskeletal e proteínas de matriz extracelular. Runx2²⁰, Hand1²¹, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 ²⁵ e Sox9²⁶ estão entre os fatores de transcrição fosfoilados no contexto do desenvolvimento craniofacial. Essa modificação pós-translacional (PTM) pode afetar diretamente a suscetibilidade a PTMs alternativos, dimerização, estabilidade, decote e/ou afinidade de vinculação de DNA, entre outras atividades 20,21,25,26. Além disso, a proteína de ligação de RNA Srsf3 é fosfoilada no contexto do desenvolvimento craniofacial, levando à sua translocação nuclear²⁷. Em geral, a fosforilação de proteínas de ligação de RNA tem sido demonstrada para afetar sua localização subcelular, interações proteína-proteína, ligação RNA e/ou especificidade de sequência²⁸. Além disso, a fosforilação da actomiose pode levar a rearranjos citosqueletal em todo o desenvolvimento craniofacial^29,30, e a fosforilação de proteínas da matriz extracelular, como pequenas ligatérias integrinas ligadas à N-proteína, contribui para a biomineralização durante o desenvolvimento esquelético³¹. Através dos exemplos acima e numerosos, é evidente que há amplas implicações para a fosforilação proteica durante o desenvolvimento craniofacial. Adicionando um nível adicional de regulação, a fosforilação proteica é ainda mais modulada por fosfattases, que neutralizam as quinases removendo grupos de fosfato.

Esses eventos de fosforilação nos níveis de receptor e molécula de efeitos são críticos para a propagação de vias de sinalização e, em última instância, resultam em mudanças na expressão genética no núcleo, conduzindo atividades celulares específicas, como migração, proliferação, sobrevivência e diferenciação, que resultam na formação adequada da face mamífera. Dada a especificidade do contexto das interações proteicas com quinases e fosfates, as mudanças resultantes nos PTMs e seus efeitos sobre a atividade celular, é fundamental que esses parâmetros sejam estudados em um cenário fisiologicamente relevante para obter uma compreensão completa da contribuição dos eventos fosforilação para o desenvolvimento craniofacial. Aqui, são fornecidos exemplos de dois contextos para estudar a fosforilação de proteínas e, assim, a ativação de vias de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilares E11,5, e células mesenquima palatinas embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5 – ambas primárias³² e imortal³³ . Na E11.5, os processos maxilarianos estão em processo de fusão com os processos nasais laterais e mediais¹, representando assim um ponto de tempo crítico durante o desenvolvimento craniofacial do rato. Além disso, processos maxilares e células derivadas das prateleiras palatais foram escolhidos aqui porque essas últimas estruturas são derivadas da primeira, proporcionando aos pesquisadores a oportunidade de interrogar a fosforilação proteica em ambientes vivos e in vitro em contextos relacionados. No entanto, este protocolo também é aplicável a processos faciais alternativos e pontos de tempo de desenvolvimento.

Um problema crítico no estudo de proteínas fosfoiladas é que elas são facilmente desfosforiladas durante o isolamento de proteínas por fosfattases ambientais abundantes. Para superar essa barreira, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento de proteínas fosforilaladas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de proteínas fosforilalatadas. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinos, podem ser usadas para obter maior visão sobre a dinâmica e os papéis de várias vias de sinalização ativas durante o desenvolvimento craniofacial.