בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. בעכבר, תהליך זה מתחיל ביום העוברי (E) 9.5 עם היווצרות הבולטות הקדמית וזוגות של תהליכים מקסילריים ומנדיבולריים, שכל אחד מהם מכיל תאי פסגה עצביים גולגולתיים לאחר נדידה. תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים נובעים מהבולטות הקדמית עם הופעת בורות האף ובסופו של דבר מתמזגים ליצירת הנחיריים. יתר על כן, תהליכי האף המדיאליים והתהליכים המקסילריים מתמזגים ליצירת השפה העליונה. במקביל, palatogenesis הוא יזם עם היווצרות של outgrowths מובהקים – מדפי palatal המשני – מן הצד האוראלי של התהליכים maxillary ב E11.5. עם הזמן, מדפי הפלטה גדלים כלפי מטה משני צדי הלשון, מתרוממים למצב מנוגד מעל הלשון, ובסופו של דבר מתמזגים בקו האמצע ויוצרים חיך רציף המפריד בין חללי האף והפומיה על ידי E16.5¹.

שינויים מורפולוגיים אלה במהלך ההתפתחות הקרניופציאלית מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. לדוגמה, קולטני קרום התא, כגון תת-קבוצות של קולטני β גורם גדילה משתנה (TGF) β, כולל קולטני חלבון מורפוגנטיים של העצם (BMPRs), ומשפחות שונות של קולטנים טירוזין קינאז (RTK), עוברים אוטופוספוריה עם קשירת ליגנד והפעלתם בתאי צמרת עצביים גולגולתיים ^2,3,4 . בנוסף, קולטן הטרנס-ממברנה המצומד לחלבון G מוחלק הופך לזרחני בתאי קרסט עצביים גולגולתיים ובאקטודרם קרניופציאלי במורד הזרם של ליגנד הקיפודים של סוניק (SHH) הנקשר לקולטן Patched1, וכתוצאה מכך הצטברות מוחלקה בקרום הציליארי והפעלת מסלול SHH⁵. אינטראקציות כאלה בין קולטני ליגנד יכולות להתרחש באמצעות איתות אוטוקרין, פרקרין ו/או ג’וקסטקרין בהקשרים קרניופציאליים. לדוגמה, ידוע כי BMP6 מאותת באופן אוטוקריני במהלך התמיינות כונדרוציטים⁶, בעוד שגורם גדילה פיברובלסט (FGF) 8 מתבטא באקטודרם קשת הלוע ונקשר לחברי משפחת FGF של RTKs המתבטאים בקשת הלוע מזנכימה באופן פאראקריני כדי ליזום דפוסים וצמיחה של קשתות הלוע^{7, 8,9,10}. יתר על כן, איתות Notch מופעל הן בכונדרוציטים והן באוסטאובלסטים במהלך התפתחות השלד הקרניופציאלי באמצעות איתות ג’וקסטקרין כאשר דלתא טרנס-ממברנה ו/או ליגנדות משוננות נקשרות לקולטני חריץ טרנס-ממברנה על תאים שכנים, אשר לאחר מכן נבקעים וזרחנים¹¹. עם זאת, ישנם זוגות אחרים של ליגנד וקולטנים החשובים להתפתחות קרניופציאלית שיש להם את הגמישות לתפקד הן באיתות אוטוקרין והן באיתות פרקרין. לדוגמה, במהלך מורפוגנזה של שן מורין, הודגם כי גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF)-AA ligand מאותת באופן אוטוקריני להפעלת RTK PDGFRα באפיתל איבר האמייל¹². לעומת זאת, בתהליכי פנים של מורין במהלך אמצע ההיריון, תעתיקים המקודדים את הליגנדות PDGF-AA ו-PDGF-CC באים לידי ביטוי באקטודרם הקרניופציאלי, בעוד שקולטן ה-PDGFRα מתבטא במזנכים הנגזרים מהפסגה העצבית הגולגולתית הבסיסית, וכתוצאה מכך ה-paracrine מאותת 13,14,15,16,17 . ללא קשר למנגנון האיתות, אירועי זרחון קולטן אלה גורמים לעתים קרובות לגיוס חלבונים מתאמים ו/או מולקולות איתות, שלעתים קרובות הופכים לזרחניים בעצמם כדי ליזום מפלים תוך-תאיים של קינאז כגון מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK)^18,19.

האפקטים התוך-תאיים הסופיים של מפלים אלה יכולים לאחר מכן לזרחן מערך של מצעים, כגון גורמי שעתוק, חלבוני RNA קושרי RNA, ציטוסקליטים ומטריצות חוץ-תאיות. Runx2²⁰, Hand1²¹, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 ²⁵, ו-Sox9²⁶ הם בין גורמי השעתוק הזרחניים בהקשר של התפתחות קרניופציאלית. שינוי פוסט-תרגומי זה (PTM) יכול להשפיע ישירות על הרגישות ל-PTMs חלופיים, דימריזציה, יציבות, מחשוף ו/או זיקה לקשירת DNA, בין פעילויות אחרות 20,21,25,26. בנוסף, החלבון קושר ה-RNA Srsf3 עובר זרחון בהקשר של התפתחות קרניופציאלית, מה שמוביל לטרנסלוקציה הגרעינית^{שלו 27}. באופן כללי, הודגם כי זרחון של חלבונים קושרי RNA משפיע על הלוקליזציה התת-תאית שלהם, על האינטראקציות בין חלבונים לחלבון, על קשירת הרנ”א ו/או על ספציפיות הרצף²⁸. יתר על כן, פוספורילציה של אקטומיוזין יכולה להוביל לסידור מחדש של השלד הציטוסקטלי במהלך התפתחות קרניופציאלית^29,30, וזרחון של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, כגון גליקופרוטאינים קטנים המקושרים לליגנד N, הקושרים אינטגרין, תורם לביומינרליזציה במהלך התפתחות השלד³¹. באמצעות הנ”ל ודוגמאות רבות אחרות, ניכר כי קיימות השלכות רחבות על זרחון חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית. הוספת רמה נוספת של ויסות, פוספורילציה של חלבונים מווסתת עוד יותר על ידי פוספטזות, אשר מנטרלות קינאזות על ידי הסרת קבוצות פוספטים.

אירועי זרחון אלה הן ברמת הקולטן והן ברמת המולקולטור הם קריטיים להפצת מסלולי איתות ובסופו של דבר גורמים לשינויים בביטוי הגנים בגרעין, המניעים פעילויות תאיות ספציפיות, כגון נדידה, התפשטות, הישרדות והתמיינות, המביאות להיווצרות נכונה של פני היונקים. בהתחשב בספציפיות ההקשר של אינטראקציות חלבונים עם קינאזות ופוספטזות, השינויים הנובעים מכך ב-PTMs והשפעתם על פעילות התאים, חשוב מאוד שהפרמטרים האלה ייחקרו בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי להשיג הבנה מלאה של התרומה של אירועי זרחון להתפתחות קרניופציאלית. כאן, מסופקות דוגמאות לשני הקשרים שבהם ניתן לחקור זרחון של חלבונים, ולפיכך, הפעלה של מסלולי איתות במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכברים מתורבתים שמקורם במדפים פאלטליים משניים E13.5 – הן ראשוניים³² והן^{מונצחים 33} . ב- E11.5, התהליכים המקסילריים נמצאים בתהליך של התמזגות עם תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים¹, ובכך מייצגים נקודת זמן קריטית במהלך התפתחות קרניופציאלית של עכבר. יתר על כן, תהליכים מקסילריים ותאים שמקורם במדפי הפלטה נבחרו כאן מכיוון שהמבנים האחרונים הם נגזרות של הראשונים, ובכך מספקים לחוקרים את ההזדמנות לחקור את זרחון החלבון in vivo ו – in vitro בהקשרים קשורים. עם זאת, פרוטוקול זה חל גם על תהליכי פנים חלופיים ונקודות זמן התפתחותיות.

בעיה קריטית בחקר חלבונים זרחניים היא שהם עוברים דה-פוספורילציה בקלות במהלך בידוד חלבונים על-ידי שפע של פוספטזות סביבתיות. כדי להתגבר על מחסום זה, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של חלבונים זרחניים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות מסופקות לניתוח נכון וכימות של חלבונים זרחניים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של מסלולי איתות שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.