Выделение лизатов цельноклеточного белка из процессов лица мыши и культивируемых клеток небной мезенхимы для анализа фосфопротеинов

Черепно-лицевое развитие млекопитающих представляет собой сложный морфологический процесс, в ходе которого несколько клеточных популяций координируются для создания фронтоназального скелета. У мышей этот процесс начинается в эмбриональный день (Е) 9,5 с образования фронтоназального протуберанца и пар верхнечелюстного и нижнечелюстного отростков, каждый из которых содержит постмигрирующие черепно-нервные гребневые клетки. Боковые и медиальные носовые процессы возникают из фронтоназального протуберанца с появлением носовых ямок и в конечном итоге сливаются с образованием ноздрей. Кроме того, медиальные носовые процессы и верхнечелюстные процессы сливаются с образованием верхней губы. Одновременно начинается палатогенез с образованием отчетливых выростов — вторичных небных полок — с ротовой стороны верхнечелюстных отростков при Е11,5. Со временем небные полки растут вниз по обе стороны языка, поднимаются в противоположное положение над языком и в конечном итоге сливаются на средней линии, образуя непрерывное небо, которое разделяет носовую и ротовую полости E16.5¹.

Эти морфологические изменения на протяжении всего черепно-лицевого развития инициируются и поддерживаются посредством различных сигнальных взаимодействий, которые часто включают фосфорилирование белка киназами. Например, рецепторы клеточной мембраны, такие как подсемейства трансформирующего фактора роста (TGF)-β рецепторов, включая костные морфогенетические белковые рецепторы (BMPR), и различные семейства рецепторов тирозинкиназы (RTK), автофосфорилируются при связывании лигандов и активации в клетках нервного гребня черепа ^2,3,4 . Кроме того, Сглаженный трансмембранный рецептор, связанный с G-белком, фосфорилируется в клетках черепного нервного гребня и черепно-лицевой эктодерме после связывания лиганда Sonic hedgehog (SHH) с рецептором Patched1, что приводит к сглаженному накоплению на цилиарной мембране и активации пути SHH⁵. Такие лиганд-рецепторные взаимодействия могут происходить через аутокринную, паракринную и/или юкстакринную передачу сигналов в черепно-лицевом контексте. Например, известно, что BMP6 сигнализирует аутокринным способом во время дифференцировки хондроцитов⁶, тогда как фактор роста фибробластов (FGF) 8 экспрессируется в эктодерме глоточной дуги и связывается с членами семейства FGF RTK, выраженными в мезенхиме глоточной дуги паракринным образом, чтобы инициировать паттернирование и рост глоточных дуг^{7, 8,9,10}. Кроме того, передача сигналов Notch активируется как в хондроцитах, так и в остеобластах во время развития черепно-лицевого скелета посредством юкстакринной сигнализации, когда трансмембранные дельта и/или зубчатые лиганды связываются с трансмембранными рецепторами Notch на соседних клетках, которые впоследствии расщепляются и фосфорилируются¹¹. Тем не менее, существуют и другие пары лигандов и рецепторов, важные для черепно-лицевого развития, которые обладают гибкостью для функционирования как в аутокринной, так и в паракринной сигнализации. Например, во время морфогенеза зуба мышей было продемонстрировано, что тромбоцитарный фактор роста (PDGF)-AA лиганд сигнализирует аутокринным способом для активации RTK PDGFRα в эпителии¹² эмалированного органа. Напротив, в мышиных лицевых процессах в середине беременности транскрипты, кодирующие лиганды PDGF-AA и PDGF-CC, экспрессируются в черепно-лицевой эктодерме, в то время как рецептор PDGFRα экспрессируется в подлежащей мезенхиме, полученной из черепного нервного гребня, в результате чего паракрин сигнализирует 13,14,15,16,17 . Независимо от сигнального механизма, эти события фосфорилирования рецепторов часто приводят к набору адапторных белков и/или сигнальных молекул, которые часто фосфорилируются сами по себе, чтобы инициировать каскады внутриклеточной киназы, такие как митоген-активированный протеинкиназный путь (MAPK)^18,19.

Концевые внутриклеточные эффекторы этих каскадов могут затем фосфорилировать массив субстратов, таких как факторы транскрипции, РНК-связывающие, цитоскелетные и внеклеточные матриксные белки. Runx2²⁰, Hand1²¹, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 ²⁵ и Sox9²⁶ относятся к числу факторов транскрипции, фосфорилированных в контексте черепно-лицевого развития. Эта посттрансляционная модификация (PTM) может непосредственно влиять на восприимчивость к альтернативным PTM, димеризацию, стабильность, расщепление и/или сродство связывания ДНК, среди других видов деятельности 20,21,25,26. Кроме того, РНК-связывающий белок Srsf3 фосфорилируется в контексте черепно-лицевого развития, что приводит к его ядерной транслокации²⁷. В целом, было показано, что фосфорилирование РНК-связывающих белков влияет на их субклеточную локализацию, белково-белковые взаимодействия, связывание РНК и/или специфичность последовательности²⁸. Кроме того, фосфорилирование актомиозина может привести к цитоскелетным перестройкам на протяжении всего черепно-лицевого развития^29,30, а фосфорилирование белков внеклеточного матрикса, таких как небольшие интегрин-связывающие лиганд N-связанные гликопротеины, способствует биоминерализации во время развития скелета³¹. Из приведенных выше и многих других примеров очевидно, что существуют широкие последствия для фосфорилирования белка во время черепно-лицевого развития. Добавляя дополнительный уровень регуляции, фосфорилирование белка дополнительно модулируется фосфатазами, которые противодействуют киназам, удаляя фосфатные группы.

Эти события фосфорилирования как на уровне рецептора, так и на уровне эффекторной молекулы имеют решающее значение для распространения сигнальных путей и в конечном итоге приводят к изменениям в экспрессии генов в ядре, стимулируя специфические клеточные активности, такие как миграция, пролиферация, выживание и дифференцировка, которые приводят к правильному формированию лица млекопитающих. Учитывая контекстную специфичность белковых взаимодействий с киназами и фосфатазами, результирующие изменения в ПТМ и их влияние на активность клеток, крайне важно, чтобы эти параметры были изучены в физиологически значимых условиях, чтобы получить полное представление о вкладе событий фосфорилирования в черепно-лицевое развитие. Здесь приведены примеры двух контекстов, в которых изучаются фосфорилирование белков и, таким образом, активация сигнальных путей во время черепно-лицевого развития млекопитающих: лицевые процессы мыши, в частности верхнечелюстные процессы E11.5, и культивируемые эмбриональные клетки небной мезенхимы мыши, полученные из вторичных небных полок E13.5 – как первичных³² , так и увековеченных³³ . При E11.5 верхнечелюстные отростки находятся в процессе слияния с боковыми и медиальными носовыми отростками¹, тем самым представляя собой критическую временную точку во время черепно-лицевого развития мыши. Кроме того, здесь были выбраны верхнечелюстные процессы и клетки, полученные из небных полок, потому что последние структуры являются производными первых, тем самым предоставляя исследователям возможность исследовать фосфорилирование белка in vivo и in vitro в смежных контекстах. Однако этот протокол также применим к альтернативным процесскам лица и временным точкам развития.

Критическая проблема в изучении фосфорилированных белков заключается в том, что они легко дефосфорилируются во время выделения белка обильными фосфатазами окружающей среды. Для преодоления этого барьера обсуждаются адаптации и модификации стандартных лабораторных методов, позволяющих выделять фосфорилированные белки. Кроме того, предоставляется передовая практика для надлежащего анализа и количественной оценки фосфорилированных белков. Эти методы, особенно в сочетании с фармакологическими ингибиторами и/или мышиными генетическими моделями, могут быть использованы для получения более глубокого представления о динамике и роли различных сигнальных путей, активных во время черепно-лицевого развития.