عزل تحلل بروتين الخلية الكاملة عن عمليات وجه الماوس وخلايا اللحمة المتوسطة الحنكية المستزرعة لتحليل البروتين الفوسفوبروتين
Summary
يقدم البروتوكول طريقة لعزل محللات بروتين الخلية الكاملة عن عمليات الوجه الجنينية للفئران التشريحية أو خلايا اللحمة الحنكية الجنينية للفئران المستزرعة وإجراء النشاف الغربي اللاحق لتقييم مستويات البروتين المفسفر.
Abstract
التطور القحفي الوجهي للثدييات هو عملية مورفولوجية معقدة تنسق خلالها مجموعات متعددة من الخلايا لتوليد الهيكل العظمي الجبهي الأنفي. تبدأ هذه التغيرات المورفولوجية وتستمر من خلال تفاعلات الإشارات المتنوعة ، والتي غالبا ما تشمل فسفرة البروتين بواسطة الكينازات. هنا ، يتم تقديم مثالين على السياقات ذات الصلة الفسيولوجية التي يمكن من خلالها دراسة فسفرة البروتينات أثناء التطور القحفي الوجهي للثدييات: عمليات وجه الفأر ، وخاصة عمليات الفك العلوي E11.5 ، وخلايا اللحمة الحنكية الجنينية للفئران المستزرعة المشتقة من أرفف الحنك الثانوية E13.5. للتغلب على الحاجز المشترك لإزالة الفسفرة أثناء عزل البروتين ، تتم مناقشة التعديلات والتعديلات على الطرق المختبرية القياسية التي تسمح بعزل البروتينات الفوسفورية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير أفضل الممارسات للتحليل السليم وتحديد كمية البروتينات الفوسفاتية بعد النشاف الغربي لتحلل بروتين الخلية الكاملة. يمكن استخدام هذه التقنيات ، خاصة بالاقتران مع المثبطات الدوائية و / أو النماذج الجينية الفئرانية ، لاكتساب نظرة ثاقبة أكبر على ديناميكيات وأدوار مختلف البروتينات الفوسفاتية النشطة أثناء التطور القحفي الوجهي.
Introduction
التطور القحفي الوجهي للثدييات هو عملية مورفولوجية معقدة تنسق خلالها مجموعات متعددة من الخلايا لتوليد الهيكل العظمي الجبهي الأنفي. في الفأر ، تبدأ هذه العملية في اليوم الجنيني (E) 9.5 مع تكوين البروز الجبهي الأنفي وأزواج من العمليات الفكية والفك السفلي ، كل منها يحتوي على خلايا القمة العصبية القحفية بعد الهجرة. تنشأ العمليات الأنفية الجانبية والإنسية من البروز الجبهي الأنفي مع ظهور حفر الأنف وتندمج في النهاية لتشكيل الخياشيم. علاوة على ذلك ، تندمج العمليات الأنفية الإنسية والعمليات الفكية لتوليد الشفة العليا. في الوقت نفسه ، يبدأ تكوين الحنك بتكوين نتوءات متميزة – الأرفف الحنكية الثانوية – من الجانب الفموي لعمليات الفك العلوي عند E11.5. بمرور الوقت ، تنمو الأرفف الحنكية لأسفل على جانبي اللسان ، وترتفع إلى وضع معاكس فوق اللسان ، وفي النهاية تندمج عند خط الوسط لتشكيل حنك مستمر يفصل بين تجاويف الأنف والفم بواسطة E16.51.
تبدأ هذه التغيرات المورفولوجية في جميع أنحاء التطور القحفي الوجهي وتستمر من خلال تفاعلات الإشارات المتنوعة ، والتي غالبا ما تشمل فسفرة البروتين بواسطة الكينازات. على سبيل المثال ، مستقبلات غشاء الخلية ، مثل العائلات الفرعية لمستقبلات عامل النمو المحول (TGF) β ، بما في ذلك مستقبلات البروتين المورفوجيني العظمي (BMPRs) ، وعائلات مستقبلات التيروزين كيناز (RTK) المختلفة ، يتم فسفرها ذاتيا عند ربط الليغاند وتنشيطه في خلايا القمة العصبية القحفية 2,3,4 . بالإضافة إلى ذلك ، يصبح مستقبل الغشاء المقترن بالبروتين G Smoothized مفسفرا في خلايا القمة العصبية القحفية والأديم الخارجي القحفي الوجهي في اتجاه مجرى النهر من ارتباط رباط القنفذ الصوتي (SHH) بمستقبل Patched1 ، مما يؤدي إلى تراكم سلس في الغشاء الهدبي وتنشيط مسار SHH5. يمكن أن تحدث مثل هذه التفاعلات بين مستقبلات الليغاند من خلال إشارات الأوتوكرين و / أو الباراكرين و / أو التجاور في السياقات القحفية الوجهية. على سبيل المثال ، من المعروف أن BMP6 يشير بطريقة أوتوكرين أثناء تمايز الخلايا الغضروفية6 ، في حين يتم التعبير عن عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) 8 في الأديم الخارجي لقوس البلعوم ويرتبط بأعضاء عائلة FGF من RTKs المعبر عنها في اللحمة المتوسطة قوس البلعوم بطريقة باراكرين لبدء نقش ونمو أقواس البلعوم7 ، 8,9,10. علاوة على ذلك ، يتم تنشيط إشارات Notch في كل من الخلايا الغضروفية والخلايا العظمية أثناء تطور الهيكل العظمي الوجهي من خلال إشارات juxtacrine عندما ترتبط Delta عبر الغشاء و / أو الأربطة الخشنة بمستقبلات Notch عبر الغشاء على الخلايا المجاورة ، والتي يتم شقها لاحقا وفسفوريلاتيد11. ومع ذلك ، هناك أزواج أخرى من الليغاند والمستقبلات مهمة للنمو القحفي الوجهي التي تتمتع بالمرونة للعمل في كل من إشارات الأوتوكرين والباراكرين. على سبيل المثال ، أثناء تكوين أسنان الفئران ، ثبت أن عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF)-AA ligand يشير بطريقة أوتوكرين لتنشيط RTK PDGFRα في ظهارة عضو المينا12. في المقابل ، في عمليات الوجه الفئرانية أثناء منتصف الحمل ، يتم التعبير عن النصوص التي تشفر الأربطة PDGF-AA و PDGF-CC في الأديم الخارجي القحفي الوجهي ، في حين يتم التعبير عن مستقبل PDGFRα في اللحمة المتوسطة المشتقة من القمة العصبية القحفية الأساسية ، مما يؤدي إلى إشارات باراكرين13،14،15،16،17 . بغض النظر عن آلية الإشارة، غالبا ما تؤدي أحداث فسفرة المستقبلات هذه إلى توظيف بروتينات محولة و / أو جزيئات إشارة، والتي غالبا ما تصبح مفسفرة نفسها لبدء شلالات كيناز داخل الخلايا مثل مسار كيناز البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK)18,19.
يمكن للمستجيبات الطرفية داخل الخلايا لهذه الشلالات بعد ذلك أن تفسر مجموعة من الركائز ، مثل عوامل النسخ ، وربط الحمض النووي الريبي ، وبروتينات المصفوفة الهيكلية الخلوية وخارج الخلية. Runx220 و Hand1 21 و Dlx3/5 22,23,24 وGli1-3 25 و Sox9 26 هي من بين عوامل النسخ المفسفرة في سياق التطور القحفي الوجهي. يمكن أن يؤثر هذا التعديل اللاحق للترجمة (PTM) بشكل مباشر على القابلية لل PTMs البديلة ، و dimerization ، والاستقرار ، والانقسام ، و / أو تقارب ربط الحمض النووي ، من بين أنشطة أخرى20،21،25،26. بالإضافة إلى ذلك ، يتم فسفرة البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي Srsf3 في سياق التطور القحفي الوجهي ، مما يؤدي إلى نقله النووي27. بشكل عام ، ثبت أن فسفرة البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي تؤثر على توطينها تحت الخلوي ، وتفاعلات البروتين والبروتين ، وربط الحمض النووي الريبي ، و / أو خصوصية التسلسل28. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي فسفرة الأكتوميوزين إلى إعادة ترتيب الهيكل الخلوي في جميع أنحاء التطور القحفي الوجهي29,30 ، وتساهم فسفرة بروتينات المصفوفة خارج الخلية ، مثل البروتينات السكرية الصغيرة المرتبطة ب ligand N المرتبطة ب integrin ، في التمعدن الحيوي أثناء تطور الهيكل العظمي31. من خلال الأمثلة المذكورة أعلاه والعديد من الأمثلة الأخرى ، من الواضح أن هناك آثارا واسعة على فسفرة البروتين أثناء التطور القحفي الوجهي. إضافة إلى مستوى إضافي من التنظيم ، يتم تعديل فسفرة البروتين بواسطة الفوسفاتيز ، الذي يتصدى للكينازات عن طريق إزالة مجموعات الفوسفات.
تعد أحداث الفسفرة هذه على كل من مستويات المستقبلات والجزيئات المستجيبة حاسمة لانتشار مسارات الإشارات وتؤدي في النهاية إلى تغييرات في التعبير الجيني في النواة ، مما يؤدي إلى أنشطة خلوية محددة ، مثل الهجرة والانتشار والبقاء والتمايز ، مما يؤدي إلى تكوين مناسب لوجه الثدييات. بالنظر إلى خصوصية سياق تفاعلات البروتين مع الكينازات والفوسفاتيز ، والتغيرات الناتجة في PTMs ، وآثارها على نشاط الخلايا ، فمن الأهمية بمكان أن تتم دراسة هذه المعلمات في بيئة ذات صلة فسيولوجيا لاكتساب فهم كامل لمساهمة أحداث الفسفرة في التطور القحفي الوجهي. هنا ، يتم تقديم أمثلة على سياقين لدراسة فسفرة البروتينات ، وبالتالي تنشيط مسارات الإشارات أثناء التطور القحفي الوجهي للثدييات: عمليات وجه الفأر ، وخاصة عمليات E11.5 الفكية ، وخلايا اللحمة المتوسطة الحنكية الجنينية للفئران المستزرعة المشتقة من الأرفف الحنكية الثانوية E13.5 – كلاهما أساسي32 وخلد33 . في E11.5 ، تكون العمليات الفكية في طور الاندماج مع العمليات الأنفية الجانبية والإنسية1 ، وبالتالي تمثل نقطة زمنية حرجة أثناء التطور القحفي الوجهي للفأر. علاوة على ذلك ، تم اختيار العمليات الفكية والخلايا المشتقة من الأرفف الحنكية هنا لأن الهياكل الأخيرة هي مشتقات من الأولى ، مما يوفر للباحثين الفرصة لاستجواب فسفرة البروتين في الجسم الحي وفي المختبر في السياقات ذات الصلة. ومع ذلك ، ينطبق هذا البروتوكول أيضا على عمليات الوجه البديلة والنقاط الزمنية التنموية.
هناك مشكلة حرجة في دراسة البروتينات المفسفرة وهي أنه يمكن إزالتها بسهولة أثناء عزل البروتين بواسطة الفوسفاتيز البيئي الوفير. للتغلب على هذا الحاجز ، تتم مناقشة التعديلات والتعديلات على الأساليب المختبرية القياسية التي تسمح بعزل البروتينات المفسفرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير أفضل الممارسات للتحليل السليم وتحديد كمية البروتينات المفسفرة. يمكن استخدام هذه التقنيات ، خاصة بالاقتران مع المثبطات الدوائية و / أو النماذج الجينية الفئرانية ، لاكتساب نظرة ثاقبة أكبر على ديناميكيات وأدوار مسارات الإشارات المختلفة النشطة أثناء التطور القحفي الوجهي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول الموصوف هنا للباحثين بالتحقيق في أحداث الإشارات الحرجة المعتمدة على الفسفرة أثناء التطور القحفي الوجهي بطريقة قوية وقابلة للتكرار. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تضمن الجمع السليم للبيانات وتحليل النتائج. سواء كان عزل البروتينات الفوسفاتية عن عمل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كانت فئران 129S4 هدية من الدكتور فيليب سوريانو ، كلية إيكان للطب في جبل سيناء. تم دعم هذا العمل بأموال من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) / المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والجمجمة (NIDCR) R01 DE027689 و K02 DE028572 إلى K.A.F. ، F31 DE029976 إلى M.A.R. و F31 DE029364 إلى B.J.C.D.
Materials
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca – 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
- Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
- Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
- MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
- Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
- Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
- Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
- Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
- Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
- Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
- Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
- Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
- Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
- Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
- Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
- Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
- Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
- Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
- Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
- Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
- Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
- Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
- Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , (2022).
- . Analyzing gels and western blots with ImageJ Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010)
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
- Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
- Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
- Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
- Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).
