Summary

リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離

Published: April 01, 2022
doi:

Summary

このプロトコルは、解剖されたマウス胚の顔面プロセスまたは培養マウス胚口蓋間葉系細胞から全細胞タンパク質溶解物を単離し、その後のウェスタンブロッティングを実行してリン酸化タンパク質レベルを評価する方法を提示する。

Abstract

哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。これらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始され、維持される。ここでは、哺乳類の頭蓋顔面発達中のタンパク質のリン酸化を研究する生理学的に関連する文脈の2つの例が提供される:マウス顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉間膜細胞。タンパク質単離中の脱リン酸化の一般的な障壁を克服するために、リンタンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、全細胞タンパク質溶解物のウェスタンブロッティング後のリンタンパク質の適切な分析および定量化のためのベストプラクティスが提供される。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活性な様々なリンタンパク質の動態および役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。

Introduction

哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。マウスでは、このプロセスは胚期(E)9.5に始まり、前頭鼻突出部および上顎および下顎突起のペアの形成が起こり、それぞれに回遊後頭蓋神経堤細胞が含まれる。側方および内側の鼻プロセスは、鼻孔の出現を伴う前頭鼻突出部から生じ、最終的に融合して鼻孔を形成する。さらに、内側鼻プロセスと上顎プロセスが融合して上唇を生成する。同時に、口蓋形成は、E11.5で上顎突起の口腔側から明確な外生(二次口蓋棚)の形成によって開始される。時間が経つにつれて、口蓋棚は舌の両側で下方に成長し、舌の上の反対の位置に上昇し、最終的に正中線で融合して、E16.51によって鼻腔と口腔を隔てる連続的な口蓋を形成する。

頭蓋顔面発達全体にわたるこれらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始および維持される。例えば、骨形成タンパク質受容体(BMPR)を含む形質転換成長因子(TGF)β受容体のサブファミリー、および種々の受容体チロシンキナーゼ(RTK)ファミリーなどの細胞膜受容体は、頭蓋神経堤細胞におけるリガンド結合および活性化時に自己リン酸化される2,3,4.さらに、平滑化されたGタンパク質共役型膜貫通型受容体は、Patched1受容体に結合するソニックヘッジホッグ(SHH)リガンドの下流の頭蓋神経堤細胞および頭蓋顔面外胚葉においてリン酸化され、毛様体膜およびSHH経路活性化5における平滑化蓄積をもたらす。このようなリガンド-受容体相互作用は、頭蓋顔面状況におけるオートクリン、パラクリン、および/またはジュクスタクリンシグナル伝達を介して起こり得る。例えば、BMP6は軟骨細胞分化6中にオートクリン様式でシグナル伝達することが知られており、一方、線維芽細胞増殖因子(FGF)8は咽頭弓外胚葉に発現し、咽頭弓間葉に発現するRTKのFGFファミリーのメンバーにパラクリン様式で結合して咽頭弓7のパターニングおよび外生を開始し8,9,10。さらに、Notchシグナル伝達は、膜貫通デルタおよび/またはギザギザリガンドが隣接する細胞上の膜貫通Notch受容体に結合し、その後切断およびリン酸化されるときに、傍タクリンシグナル伝達を介して、頭蓋顔面骨格発達中に軟骨細胞および骨芽細胞の両方で活性化される11。しかし、頭蓋顔面発達にとって重要な他のリガンドおよび受容体対は、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達の両方において機能する柔軟性を有する。一例として、マウス歯の形態形成中に、血小板由来成長因子(PDGF)−AAリガンドがオートクリン様式でシグナル伝達し、エナメル器官上皮12中のRTK PDGFRαを活性化することが実証された。対照的に、妊娠中期のマウス顔面突起では、リガンドPDGF-AAおよびPDGF-CCをコードする転写産物が頭蓋顔面外胚葉で発現し、一方、PDGFRα受容体は下層の頭蓋神経堤由来間葉系で発現され、パラクリンシグナル伝達をもたらす1314151617.シグナル伝達機構にかかわらず、これらの受容体リン酸化事象は、しばしばアダプタータンパク質および/またはシグナル伝達分子の動員をもたらし、それらはしばしばそれ自体がリン酸化されてマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路などの細胞内キナーゼカスケードを開始する18,19

これらのカスケードの末端細胞内エフェクターは、転写因子、RNA結合、細胞骨格および細胞外マトリックスタンパク質などの基質の配列をリン酸化することができる。Runx220、Hand1 21、Dlx3/5 22、23、24、Gli1-3 25およびSox9 26は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化された転写因子の1つである。この翻訳後修飾(PTM)は、他の活性の中でも特に、代替PTMに対する感受性、二量体化、安定性、切断、および/またはDNA結合親和性に直接影響し得る20212526さらに、RNA結合タンパク質Srsf3は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化され、その核移行をもたらす27。一般に、RNA結合タンパク質のリン酸化は、その細胞内局在化、タンパク質間相互作用、RNA結合、および/または配列特異性に影響を及ぼすことが示されている28。さらに、アクトミオシンのリン酸化は、頭蓋顔面発生2930全体にわたる細胞骨格再配列をもたらし得、小さなインテグリン結合リガンドN結合型糖タンパク質などの細胞外マトリックスタンパク質のリン酸化は骨格発生中のバイオミネラリゼーションに寄与する31。上記および他の多くの例を通して、頭蓋顔面発達中のタンパク質リン酸化に幅広い意味合いがあることは明らかである。さらなるレベルの調節を加えると、タンパク質リン酸化はホスファターゼによってさらに調節され、ホスファターゼはリン酸基を除去することによってキナーゼを打ち消す。

受容体レベルとエフェクター分子レベルの両方でのこれらのリン酸化事象は、シグナル伝達経路の伝播にとって重要であり、最終的には核内の遺伝子発現の変化をもたらし、遊走、増殖、生存、分化などの特定の細胞活性を駆動し、哺乳動物の顔の適切な形成をもたらす。キナーゼおよびホスファターゼとのタンパク質相互作用の状況特異性、PTMの結果生じる変化、および細胞活性に対するそれらの影響を考慮すると、これらのパラメータを生理学的に関連する設定で研究することが重要であり、頭蓋顔面発達に対するリン酸化事象の寄与を完全に理解する。ここでは、タンパク質のリン酸化、したがって哺乳類の頭蓋顔面発達中のシグナル伝達経路の活性化を研究するための2つの文脈の例が提供される:マウスの顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉細胞 – 一次32および不死化33の両方.E11.5では、上顎突起は側鼻突起および内側鼻突起1と融合する過程にあり、それによってマウス頭蓋顔面発達中の臨界時点を表す。さらに、口蓋棚に由来する上顎プロセスおよび細胞がここで選択されたのは、後者の構造が前者の誘導体であり、それによって研究者に、関連する文脈においてインビボおよびインビトロでタンパク質リン酸化を調査する機会を提供するからである。しかし、このプロトコルは、代替の顔のプロセスや発達の時点にも適用できます。

リン酸化タンパク質を研究する上で重要な問題は、豊富な環境ホスファターゼによってタンパク質単離中に容易に脱リン酸化されることである。この障壁を克服するために、リン酸化タンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、リン酸化タンパク質の適切な分析と定量のためのベストプラクティスが提供されています。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活動する様々なシグナル伝達経路のダイナミクスおよび役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。

Protocol

動物を含むすべての手順は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、施設のガイドラインおよび規制に準拠して実施されました。生後1.5~6ヶ月の雌129S4マウスを21~23°Cの亜熱中性温度で飼育し、胚採取に用いた。プロトコルの概略ワークフローを 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材?…

Representative Results

マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉系細胞から単離されたタンパク質のリン酸化を特徴付けようとする場合、代表的な結果は、対応する総タンパク質バンドの高さまたはその近くで実行される抗リンタンパク質抗体によるウェスタンブロッティング後の、明確で再現性のあるバンドを理想的に明らかにするであろう(図3).しかしながら、タンパク質の広範?…

Discussion

ここで説明するプロトコルにより、研究者は頭蓋顔面発達中の重要なリン酸化依存性シグナル伝達事象を堅牢かつ再現可能な方法でプローブすることができます。このプロトコルには、データの適切な収集と結果の分析を保証するいくつかの重要なステップがあります。マウスの顔面プロセスおよび/または培養口蓋間葉細胞からリンタンパク質を単離するかどうかにかかわらず、指示された…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

129S4マウスは、シナイ山のアイカーン医科大学のフィリップ・ソリアーノ博士からの贈り物でした。この研究は、国立衛生研究所(NIH)/国立歯科頭蓋顔面研究所(NIDCR)R01 DE027689およびK02 DE028572からK.A.F.、F31 DE029976からM.A.R.、F31 DE029364からB.J.C.D.への資金で支援されました。

Materials

Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca – 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

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Cite This Article
Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

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