Otoimmün Ensefalitte Yer Alan Yeni Patojenik Antikorları Tespit Etmek ve İncelemek için Hipokampal Nöronal Kültürler

Tüm prosedürler, deney hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili Avrupa (2010/63/UE) düzenlemelerini takiben Barselona Üniversitesi yerel etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı ve çalışma, insan örneklerinin kullanımı için yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylandı (Hospital Clínic, HCB / 2018/0192). NOT: Geçerli protokolde üç bölüm vardır. Birincisi nöronal kültürlerin kurulması, ikincisi nöronların canlı kültürlerini kullanarak yüzey antikorlarının tespiti ve üçüncüsü bu antikorların patojenitesini belirlemektir. BÖLÜM 1: Ayrışmış, fetal, kemirgen hipokampal nöronal kültürlerin kurulması 1. Hazırlık adımları Kaplama yüzeylerinin Poli-L-Lizin kaplaması (diseksiyondan 3 gün önce)Borat tamponunu, 500 mL damıtılmış suya 2.38 g borik asit ve 1.27 g boraks ekleyerek ve eriyene kadar 15 dakika karıştırarak hazırlayın. Bir kaputun altında, tampon çözeltisini filtreleyerek (0,2 μm gözenek boyutu) sterilize edin, etiketleyin ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.NOT: Bu çözelti kararlıdır ve 6 ay boyunca kullanılabilir.DİKKAT: Borat tamponu hazırlarken, önerilen kişisel koruyucu ekipmanı kullanın. Poli-L-Lizin (PLL) stok çözeltisini (100 mg / mL) 10 mL damıtılmış suya 1 g PLL ekleyerek ve çözünene kadar karıştırarak hazırlayın. 500 μL PLL stok çözeltisi alikotu hazırlayın. 1 mg / mL’lik nihai bir konsantrasyona ulaşmak için, 50 mL borat tamponuna 500 μL PLL aliquot ekleyin ve çözünene kadar girdap yapın ve çözeltiyi filtreleyerek sterilize edin (0.2 μm gözenek boyutu).NOT: Bu çözelti kararlıdır ve 6 ay boyunca kullanılabilir. Yüzeyleri kaplama için hazırlayın. İmmün boyama prosedürleri için 12 mm çapında kapaklar ve canlı nöronların görüntülenmesini içerecek çalışmalar için cam tabanlı tabaklar kullanın. Kapak kayışı kullanıyorsanız, otoklav yapın ve ardından her bir kaba (3,5 cm çaplı) beş kapak kapağı yerleştirin.NOT: Kapak kapağının kalınlığı, elde edilen görüntülerin sinyalinin kalitesini ve yoğunluğunu etkiler. Çoğu mikroskop hedefi, # 1.5 kapak kaymaları için tasarlanmıştır. Görüntüleme kurulumuna ve tekniklerine göre uygun kapak kapaklarını seçin. Bir kaputun altında, her bir tabağa 1,5 mL PLL çözeltisi ekleyin (cam tabanlı tabak veya beş kapaklı 3,5 cm’lik tabak). Tüm kapak kapaklarının suya batırıldığından ve RT’de 24 saat boyunca saklandığından emin olun. Diseksiyondan 2 gün önce, PLL çözeltisini aspire edin ve steril endotoksin içermeyen suyla yıkayın, kapak kapaklarının suya batırıldığından emin olun. Suyu bulaşıklarda tutun ve RT’de 24 saat saklayın. Diseksiyondan 1 gün önce, suyu aspire edin ve NB + B27 kültür ortamı ile değiştirin (aşağıya bakınız) ve bulaşıkları 24 saat boyunca 37 ° C’de bir inkübatöre yerleştirin. Kültür ortamı ve stok çözeltisinin hazırlanması (diseksiyondan 1 gün önce)Dulbecco’nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM): L-Glutamin ve fenol kırmızısı olmadan 500 mL DMEM Yüksek Glikozuna (4.5 g / L), 50 mL at serumu, 50 mL fetal sığır serumu (FBS), 10 mL L-glutamin (200 mM), 10 mL sodyum piruvat (100 mM), 10 mL penisilin-streptomisin (10.000 U / mL) ekleyin. Filtreleyin (0,2 μm gözenek boyutu) ve sıkıca kapalı bir kapakla 4 oC’de 5 mL alikotlarda saklayın.NOT: Bu çözelti kararlıdır ve 1 ay boyunca kullanılabilir. B27 (NB + B27) ile desteklenmiş nörobazal (NB) ortam: Fenol kırmızısı olmadan 50 mL NB ortamına 1 mL B27 takviyesi ekleyin. B27 (Hazırda Bekletme + B27) ile desteklenmiş hazırda bekletme-E ortamı: 50 mL Hazırda Bekletme-E ortamına 1 mL B27 takviyesi ekleyin. Hücre Dışı Fizyolojik Çözelti (EPS): 1 L steril suya, belirtilen son konsantrasyonlarda aşağıdakileri ekleyin: NaCl (140 mM), KCl (3.5 mM), HEPES (10 mM), glikoz (20 mM) ve CaCl 2 (2 mM). Çözünene kadar karıştırın ve NaOH (0,5 M) veya HCl (0,5 M) ekleyerek pH’ı 7,4’e ayarlayın. Kaputun altında, filtreleyerek (0,2 μm gözenek boyutu) sterilize edin ve 4 oC’de saklayın. Ekipman ve diğer laboratuvar malzemeleri (diseksiyon günü)Su banyosunu 37 °C’ye ayarlayın. Aşağıdaki alikotları ısıtın: 50 mL HBSS ve 5 mL DMEM. Mutlak etanol içeren bir beherin içine daldırarak aşağıdaki aletleri sterilize edin (Şekil 1B): forseps, kavisli forseps, makas, ince kavisli forseps, ince düz forseps, ameliyat makasları, ince açılı forseps ve hassas yaylı makas.NOT: Aletleri korumak için, kabın altına yumuşak bir malzeme (örneğin, bilimsel hassas mendiller) yerleştirin. İki tepsiyi buzla doldurun ve aşağıdaki öğeleri yerleştirin.Buz tepsisi 1 (Şekil 1C): Cerrahi aletleri mutlak etanol içeren beherin içine, cerrahi aletleri durulamak için HBSS’li bir beher, embriyoları yerleştirmek için HBSS’li 10 cm’lik bir tabağı, embriyoların kafalarını yerleştirmek için HBSS’li 6 cm’lik bir tabağı ve embriyoların beyinlerini yerleştirmek için Hibernate + B27’li 6 cm’lik bir tabağı yerleştirin. Buz tepsisi 2: Disseke hipokampus için 1 mL’lik bir tripsin aliquot 2.5% ve Hibernate + B27 ile 3.5 cm’lik bir tabak yerleştirin.NOT: Bu prosedür için gereken süre, araştırmacının deneyimine ve diseke edilecek embriyo sayısına bağlıdır. Bu nedenle, buz gerekli süre boyunca donmuş kalmalıdır. Bu amaçla polistiren tepsiler önerilir. 2. Diseksiyon ve tohumlama (Şekil 1) Hipokampal izolasyonNOT: E18’de embriyosu olan gebe sıçanlar, Barselona Üniversitesi yerel etik komitesine uygun olarak, deney hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili Avrupa (2010/63/UE) yönetmeliklerine uygun olarak, protokol başlamadan hemen önce ötenazi yapılır. Bu protokolde ötenazi yöntemi olarak karbondioksit (CO2) inhalasyonu kullanılmıştır.Forseps ve makas kullanarak sıçanı abdominal periton seviyesinde disseke edin. Uterusu E18 embriyolarıyla çıkarın ve buz üzerinde soğutulmuş 10 cm’lik bir kaba koyun.NOT: Sıçan kıllarının embriyolara yapışmasını önlemek önemlidir. Karnı sterilize etmek için bol miktarda% 70 etanol kullanılması önerilir. Bu adımdan itibaren, buz tepsisi 1’deki kaputun içinde çalışın. Embriyonik keseleri açın ve embriyoları HBSS ile 10 cm’lik kaba aktarın, embriyoların tamamen daldırıldığından emin olun. Embriyo kafasını makasla çıkarın ve HBSS ile 6 cm’lik tabağa yerleştirin. Bu işlemi tüm embriyolarla tekrarlayın.NOT: Kontaminasyonu önlemek için, embriyo kafaları dışındaki tüm dokular vidalı kapaklı bir kaba atılmalıdır. Embriyo kafasını ince kavisli forsepslerle tutun ve yörüngeleri bir çift ince-düz forseps ile delin, 45° açıyla girin ve ardından ince kavisli forsepsleri serbest bırakın.NOT: Forseps beyinden geçmemelidir, bu nedenle girerken açıyı korumak önemlidir. Oksipital kemikten başlayarak frontal kemiğe kadar cerrahi makasla cildi ve kafatasını disseke edin. Beyni bir çift ince kavisli forseps ile çıkarın ve Hibernate + B27 ile 6 cm’lik kaba koyun. Tüm beyinler iyileşene kadar bu işlemi tekrarlayın. Telensefalonları ince düz forsepslerle Sagittal olarak ayırın.NOT: Bu adımdan itibaren, hipokampusun diseksiyonu bir stereomikroskop altında gerçekleştirilir. Işığın diseksiyon yüzeyini yanlardan aydınlatması için mafsallı lambaların kullanılması önerilir. Ayrıca, hipokampüsün daha iyi ayırt edilmesini sağlayan daha fazla kontrast sağladığı için siyah bir arka plan kullanılması önerilir. Hibernate + B27 damlalarını 1 cm mesafeye (örneğin, bir daire içinde) yerleştirerek 10 cm’lik bir yemek hazırlayın. Hibernate + B27 damlası başına bir telensefalon yerleştirin ve diseksiyon kapsamı boyunca görselleştirin (1.25x objektif büyütme önerilir). Meninksleri dikkatlice soyun ve hipokampüsü daha iyi görselleştirmek için talamusu çıkarın. Hipokampüsü hassas yaylı makasla inceleyin ve buz tepsisi 2’de Hibernate + B27 ile 3,5 cm’lik kaba yerleştirin. Tüm hipokampuslar toplanana kadar her telensefalon için tekrarlayın. Tüm hipokampusları bir Pasteur pipetle dikkatlice toplayın ve 50 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: Tripsini seyreltmemek için hipokampiyi toplarken minimum Hazırda Bekletme + B27 hacmini alın. Hücre ayrışmasıHipokampusun enzimatik ayrışmasıHipokampi içeren 50 mL’lik tüpte, 1 mL% 2.5 tripsin ekleyin ve HBSS ile 5 mL’lik bir hacme getirin. 37 ° C’de su banyosunda 15 dakika boyunca inkübe edin. Tripsini seyreltmek için, 10 mL önceden ısıtılmış HBSS ekleyin ve 37 ° C’deki su banyosunda 5 dakika boyunca inkübe edin. Şimdi mukus kütlesi olarak görünen hipokampiyi, 1.000 μL mikropipet ile 50 mL’lik bir tüpe aktarın, 6 mL önceden ısıtılmış HBSS ekleyin ve 37 ° C’de su banyosunda 5 dakika boyunca inkübe edin. Hipokampusun mekanik ayrışmasıKütleyi, minimum hacmi alarak konik tabanlı 2 mL’lik bir tüpe aktarın. 1 mL önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekleyin. Pelet, yukarı ve aşağı doğru hafifçe aspire ederek 1.000 μL mikropipet ile homojenize edin.NOT: Aspirasyon yaparken kabarcık üretmekten kaçınmak çok önemlidir, çünkü kabarcıklar hücreleri lize edebilir. Yukarı ve aşağı aspirasyonu, ucu tüpün konik tabanıyla temas halinde olacak şekilde önceden çekilmiş bir cam pipetle (10x-20x) tekrarlayın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının. Bu adımın sonunda, karışım yarı saydam olmalıdır. Karışım yarı saydam olacak şekilde homojen olarak karıştırıldıktan sonra, karışımı 37 °C’de 4 mL DMEM ortamı içeren bir tüpe aktarın ve yukarı ve aşağı pipetle indirerek bir cam pipetle homojenize edin. Hücre tohumlamaHücreleri sayın. Çözeltideki nöronların sayısı standart laboratuvar prosedürlerine göre sayılabilir.NOT: Antikor tespiti ve kalsiyum aktivitesi için görüntüleme deneylerinde, 3,5 cm’lik çanak başına 50.000 hücre konsantrasyonu en uygunudur. Hücreleri askıda tutarak, hesaplanan hacmi geri çekin ve PLL kaplı kapaklar içeren 3,5 cm’lik tabaklarda veya PLL kaplı cam tabanlı tabaklarda tabaklayın. Çapraz hareketlerle yumuşak bir şekilde sallayarak (ileri geri, sonra yan yana; gerektiğinde tekrarlayın) bulaşıkların üzerindeki hücreleri eşit olarak dağıtın ve bulaşıkları CO2 (% 5) inkübatörüne yerleştirin.NOT: Hücrelerin çanağın çevresine yerleşmesini önlemek için çapraz hareketler kullanmak önemlidir. Her hafta yaklaşık 1 mL NB + B27 ekleyin, böylece kültür kurumaz.NOT: 2 hafta sonra (14 gün in vitro [div]), nöronlar olgunlaşır ve deney için kullanılacak tüm faktörleri ifade eder. Bu protokol kullanılarak elde edilen toplam ortalama nöron sayısı, gebe sıçan başına ortalama 12 E18 embriyodan gelen yaklaşık 2.5 x 106 nörondur.    BÖLÜM 2: Nöronal hücre yüzey proteinlerinde antikor tespiti için hipokampal nöronal kültürlerin kullanılması NOT: Protokolün bu bölümü, anti-NMDAR ensefalitli hastaların serumunda ve / veya CSF’sinde anti-NMDAR antikorlarını tanımlamak için hipokampal kültürlerin nasıl kullanıldığını göstermektedir. Floresan immün boyama, canlı nöronlardaki reaktiviteyi görselleştirmek için kullanılır, ancak diğer görselleştirme yöntemleri de kullanılabilir. Bu deney için uygun bir kontrol, sağlıklı bir bireyden serum veya BOS olacaktır. İnsan örneklerini kullanırken, kurumsal etik komiteden onay alınması gerekebileceğini unutmayın. 3. Canlı floresan immün boyama Kapak fişlerinde yetiştirilmiş 14 div hücresi kullanın (beş kapak fişi içeren 3,5 cm’lik çanak başına 50.000 hücre). Kaputun içinde, kapak kapaklarını NB ile önceden ısıtılmış 37 ° C’ye kadar durulayın. Bu durumda, NB ortamında serum için 1:200’de veya BOS için 1:2’de seyreltilmiş anti-NMDAR antikorları (birincil antikor olarak kullanılır) içeren numuneyi ekleyin ve 37 ° C’de (CO2 (% 5) inkübatörünün içinde) 1 saat inkübe edin. RT’de PBS 3x ile dikkatlice durulayın. Fiksasyon çözeltisi (PBS’de% 4 formaldehit) ekleyin ve RT’de 5 dakika inkübe edin.DİKKAT: %4 formaldehit kullanırken, kaputun içinde çalışın ve önerilen kişisel koruyucu ekipmanı giyin. Her biri 5 dakika boyunca PBS ile 3 kat yıkayın. İkincil antikor Keçi anti-İnsan AF488’i 1:1000 seyreltmede ekleyin ve RT’de 1 saat boyunca inkübe edin.NOT: Kuluçka sırasında, alüminyum folyo ile kaplayarak ışığa maruz kalmaktan koruyun. Her biri 5 dakika boyunca PBS ile 3 kat yıkayın. Damıtılmış su ile durulayın Kapak fişlerini sıvı bir montaj ortamıyla (örneğin, DAPI ile solmaya karşı koruma ortamı; yaklaşık 7 μL) monte edin, kalan sıvıyı aspire edin ve damıtılmış suyla durulayın. Nöronlar artık floresan görüntüleme için hazır.DİKKAT: Montaj ortamını tutarken, önerilen kişisel koruyucu ekipmanı kullanın.     BÖLÜM 3: Kalsiyum görüntüleme kullanılarak antikor patojenik etkilerinin gösterilmesi NOT: Protokolün bu kısmı, hastalardaki antikorların kültürler üzerinde fonksiyonel bir etkiye sahip olup olmadığının nasıl belirleneceğini göstermektedir, bu da patojeniteyi düşündürecektir. Etkilerin önemini arttırmak için, sekiz hastadan bir BOS havuzu kullanıldı. Canlı kültürlerin kalsiyum aktivitesi, GECI floresan kalsiyum göstergesi (GCaMP5G) kullanılarak kimyasal stimülasyon (NMDA + Glisin) üzerine kaydedildi. Bu çalışmalar, nöronların gerekli fizyolojik koşullarını koruyabilen bir hücre odasına sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu gerektirir. 4. Kalsiyum görüntüleme Kapak fişlerinde yetiştirilmiş 14-18 div hücresi kullanın (beş kapaklı 3,5 cm’lik tabak başına 50.000 hücre) Görüntülemeden 1 hafta önce, hücrelere 2.5 x 10 10 GC / mL’de viral vektör pAAV2-CAG-GCaMP5G’yi ekleyin ve 5-7 gün boyunca inkübe edin.NOT: Ticari olarak temin edilebilen, önceden paketlenmiş AAV serotip 2 vektörü, bir CAG promotörü altında genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi GCaMP5G’yi aşırı eksprese eder. Görüntülemeden 1 gün önce, hasta örneğini ekleyin (bu örnekte, NB + B27’de 1:25 seyreltilmiş bir BOS havuzu) ve 24 saat boyunca inkübe edin. Kontaminasyonu önlemek için insan numunelerini (0,2 μm gözenek boyutu) kullanmadan önce daima süzün.NOT: Bu çalışmalar için, sağlıklı deneklerden kontrol BOS’unun paralel olarak çalıştırılması gerekir. Görüntüleme gününde, görüntüleme kurulumunu hazırlayın ve mikroskop hücre odasını 37 ° C’ye ayarlayın, şeridi damıtılmış suyla doldurun ve hücre fizyolojik koşullarını korumak için% 5 CO2 ile demleyin. Davlumbazda, hücreleri Adım 3’ten 37 ° C’ye önceden ısıtılmış 3 mL EPS ile yıkayın Hücreleri 2.45 mL EPS ile örtün ve mikroskop hücre odasına aktarın. Yalnızca NMDA reseptör yanıtını görselleştirmek üzere AMPA ve KA reseptörlerini bloke etmek için NBQX (10 μM) ekleyin. Bir cıva lambası ve bir FITC filtre küpü ile donatılmış ters floresan mikroskopta, her 100 ms’de bir kaydedilen karelerle (kendiliğinden aktivite) 2 dakikalık bir film elde edin.NOT: 20x NA 0,75 hava hedefi kullanıldı ve sCMOS kamera ile her 100 ms’de bir görüntü (512 x 512 piksel, 16 bit gri tonlamalı) çekildi. Her 100 ms’de bir kaydedilen karelerle 4 dakikalık ikinci filmi edinin. Edinime başladıktan kısa bir süre sonra, yemeğe stimülasyon çözeltisi (NMDA [100 μM] + Glisin [1 μM]) ekleyin.NOT: Çanağa ortam eklenmesi, görüntüleme koşullarını (odak, floresan yoğunluğu ve / veya spesifik olmayan arka plan sinyali) bozabilecek türbülans üretecektir. Bu tür değişikliklerin olasılığını azaltmak için doldurulmuş 2,5 mL’lik kaba 50 μL’den fazla çözelti eklemeyin. Görüntü işleme yazılımını kullanarak (burada ImageJ kullanılmıştır), stimülasyon üzerine elde edilen floresan sinyalini zamanla hasta ile inkübe edilen kültürlerden çıkarın ve BOS örneklerini kontrol edin.NOT: GCaMP probları, serbest kalsiyum iyonlarına bağlanırken, daha parlak olmalarına neden olan konformasyonel bir değişikliğe uğrarlar. Bu nedenle, floresan yoğunluğundaki artış, nöronal depolarizasyona bağlı bir kalsiyum akışı ile ilişkilidir. Analiz edilecek ilgi bölgelerini (ROI) belirleyin. Nöronların somalarını manuel olarak segmentlere ayırın ve YG’leri YG yöneticisine ekleyin (Yatırım Getirisi Yöneticisi’> > Araçlarını Analiz Edin > Ekleyin). YG’yi YG Yöneticisi menüsünden kaydedin (Kaydet > daha fazlası). Ölçümleri ayarlayın (Ölçümleri analiz et > ayarla) ve Ortalama gri değerini seçin. Daha > Çoklu Ölçü’yü tıklatarak hücre somalarından ortalama floresan yoğunluk profilini ayıklayın ve ardından oluşturulan tabloyu .xls bir elektronik tablo olarak kaydedin. Gruplar arasındaki floresanı karşılaştırmak için istatistiksel analizler yapın (hastanın CSF’sine karşı kontrolün CSF’si).