自己免疫性脳炎に関与する新しい病原性抗体を検出および研究するための海馬神経培養

すべての手順は、実験動物の使用と世話に関するヨーロッパ(2010/63 / UE)の規制に従って、バルセロナ大学の地元の倫理委員会によって承認されました。患者から書面によるインフォームドコンセントが得られ、研究はヒトサンプルの使用について地元の施設内審査委員会によって承認されました(Hospital Clínic、HCB / 2018/0192)。 注: 現在のプロトコルには 3 つの部分があります。1つ目は神経細胞培養の確立、2つ目は神経細胞の生培養を用いた表面抗体の検出、3つ目はこれらの抗体の病原性の決定です。 第1部:解離性、胎児性、げっ歯類の海馬神経培養の確立 1.準備手順 めっき表面のポリ-L-リジンコーティング(解剖の3日前)500 mLの蒸留水に2.38 gのホウ酸と1.27 gのホウ砂を加え、溶解するまで15分間攪拌することにより、ホウ酸緩衝液を調製します。フードの下で、緩衝液をろ過(0.2 μmの孔径)で滅菌し、ラベルを付けて室温(RT)で保存します。注:このソリューションは安定しており、6か月間使用できます。注意: ホウ酸塩バッファーを準備するときは、推奨される個人用保護具を着用してください。 1 gのPLLを10 mLの蒸留水に加え、溶解するまで攪拌することにより、ポリ-L-リジン(PLL)ストック溶液(100 mg / mL)を調製します。500 μLのPLLストック溶液を調製します。最終濃度1 mg/mLに達するには、500 μLのPLLアリコートを50 mLのホウ酸緩衝液に加え、溶解するまで旋回させ、溶液をろ過して滅菌します(孔径0.2 μm)。注:このソリューションは安定しており、6か月間使用できます。 コーティングする表面を準備します。免疫染色手順には直径12 mmのカバーガラスを使用し、生きたニューロンのイメージングを含む研究にはガラス底皿を使用します。カバーガラスを使用する場合は、オートクレーブしてから、各皿(直径3.5 cm)に5つのカバーガラスを置きます。注意: カバーガラスの厚さは、取得した画像の信号の品質と強度に影響します。ほとんどの顕微鏡対物レンズは、#1.5カバーガラス用に設計されています。イメージングのセットアップと技術に応じて適切なカバーガラスを選択してください。 フードの下で、各皿に1.5 mLのPLL溶液を加えます(ガラス底の皿または5つのカバーガラスが付いた3.5 cmの皿)。すべてのカバーガラスが水没し、RTで24時間保管されていることを確認してください。 解剖の2日前に、PLL溶液を吸引し、滅菌したエンドトキシンフリー水で洗浄し、カバーガラスが水没していることを確認します。皿に水を入れ、RTで24時間保管します。 解剖の1日前に、水を吸引してNB + B27培地(下記参照)と交換し、皿を37°Cのインキュベーターに24時間入れます。 培地および原液の調製(解剖の1日前)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM):L-グルタミンとフェノールレッドを含まない500 mLのDMEM高グルコース(4.5 g / L)に、50 mLの馬血清、50 mLのウシ胎児血清(FBS)、10 mLのL-グルタミン(200 mM)、10 mLのピルビン酸ナトリウム(100 mM)、10 mLのペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)を追加します。フィルター(孔径0.2 μm)し、キャップを密閉した状態で4 oCで5 mLアリコートで保管します。注:このソリューションは安定しており、1か月間使用できます。 B27を添加したニューロバクサル(NB)培地(NB + B27):フェノールレッドを含まない50 mLのNB培地に、1 mLのB27サプリメントを追加します。 B27を添加したHibernate-E培地(Hibernate + B27):50 mLのHibernate-E培地に、1 mLのB27サプリメントを加える。 細胞外生理溶液(EPS):滅菌水1Lに、指定された最終濃度で次のものを加えます:NaCl(140 mM)、KCl(3.5 mM)、HEPES(10 mM)、グルコース(20 mM)、およびCaCl 2(2 mM)。溶解するまで攪拌し、NaOH(0.5 M)またはHCl(0.5 M)を加えてpHを7.4に調整します。フードの下で、ろ過(孔径0.2μm)で滅菌し、4°Cで保管します。 機器・その他実験材料(解剖当日)ウォーターバスを37°Cに設定します。 次のアリコートを加熱します:50 mLのHBSSおよび5 mLのDMEM。 無水エタノールを含むビーカーに浸して次のツールを滅菌します(図1B):鉗子、湾曲した鉗子、はさみ、細湾曲した鉗子、細い直線鉗子、手術用はさみ、細かい角度の鉗子、および精密ばねはさみ。注意: ツールを保護するために、ビーカーの下部に柔らかい素材(科学精密ワイプなど)を配置します。 2つのトレイに氷を入れ、次のアイテムを置きます。アイストレイ1(図1C):無水エタノールを入れたビーカーに手術器具を入れ、手術器具をすすぐためのHBSSを入れたビーカー、胚を入れるためのHBSSを入れた10cmの皿、胚の頭を置くためのHBSSを入れた6cmの皿、胚の脳を置くためのHibernate + B27を入れた6cmの皿を置きます。 アイストレイ2:解剖した海馬用に、トリプシン2.5%のアリコート1 mLと、休止状態+ B27を入れた3.5 cmの皿を置きます。注:この手順に必要な時間は、研究者の経験と解剖する胚の数によって異なります。したがって、氷は必要な時間凍結したままでなければなりません。この目的にはポリスチレントレイをお勧めします。 2.解剖と播種(図1) 海馬隔離注:E18で胚を持つ妊娠中のラットは、実験動物の使用と世話に関するヨーロッパ(2010/63 / UE)の規制に従って、バルセロナ大学の地元の倫理委員会に従ってプロトコルが始まる直前に安楽死させます。このプロトコルでは、安楽死の方法として二酸化炭素(CO2)吸入が使用されました。鉗子とはさみを使用して腹部腹膜のレベルでラットを解剖する。E18胚で子宮を抽出し、氷の上で冷やした10 cmの皿に入れます。注:ラットの毛が胚に付着しないようにすることが重要です。腹部を消毒するために大量の70%エタノールを使用することをお勧めします。このステップ以降、製氷皿1のフード内で作業します。 胚嚢を開き、HBSSで10cmの皿に胚を移し、胚が完全に浸っていることを確認します。 ハサミで胚の頭を取り除き、HBSSで6 cmの皿に入れます。すべての胚でこのプロセスを繰り返します。注意: 汚染を避けるために、胚の頭を除くすべての組織はスクリューキャップ付きの容器に捨てる必要があります。 細かい湾曲した鉗子で胚の頭を持ち、45°の角度で入る一対の細かいまっすぐな鉗子で軌道を突き刺してから、細かく湾曲した鉗子を解放します。注:鉗子は脳を通過してはならないため、入るときは角度を維持することが重要です。 後頭骨から前頭骨まで、手術用ハサミで皮膚と頭蓋骨を解剖します。一対の細かい湾曲した鉗子で脳を取り除き、冬眠+ B27で6 cmの皿に入れます。すべての脳が回復するまでこのプロセスを繰り返します。 末脳を細かいまっすぐな鉗子で矢状に分離します。注:このステップ以降、海馬の解剖は実体顕微鏡下で行われます。光が解剖面を側面から照らすように、関節式ランプを使用することをお勧めします。また、黒の背景を使用するとコントラストが高くなり、海馬をよりよく区別できるため、黒の背景を使用することをお勧めします。 Hibernate + B27の滴を1 cmの距離(円など)に置いて、10 cmの皿を準備します。Hibernate + B27の1滴あたり1つの終脳を置き、解剖スコープを通して視覚化します(1.25倍の対物倍率を推奨)。 髄膜を慎重に剥がし、視床を取り除き、海馬をよりよく視覚化します。 精密スプリングハサミで海馬を解剖し、氷皿2.5の冬眠+ B27を入れた2cmの皿に入れます。すべての海馬が収集されるまで、すべての終脳について繰り返します。 パスツールピペットですべての海馬を注意深く集め、50 mLチューブに移します。注:海馬を収集するときは、トリプシンを希釈しないように、休止状態+ B27の最小量を服用してください。 細胞解離海馬の酵素的解離海馬を含む50 mLチューブに、1 mLの2.5%トリプシンを加え、HBSSで5 mLの容量にします。37°Cの水浴中で15分間インキュベートします。 トリプシンを希釈するには、予熱したHBSS10 mLを加え、37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。 粘液塊として現れた海馬を1,000 μLのマイクロピペットで50 mLのチューブに移し、6 mLの予熱したHBSSを加え、37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。 海馬の機械的解離質量を円錐形の底部を有する2mLチューブに移し、最小容量を取る。予熱したDMEM培地を1mL加えます。ペレットを1,000 μLのマイクロピペットで穏やかに上下に吸引して均質化します。注:気泡が細胞を溶解する可能性があるため、吸引するときは気泡の発生を避けることが重要です。 先端をチューブの円錐形の底に接触させた状態で、事前に引っ張られたガラスピペット(10x-20x)で上下の吸引を繰り返します。気泡の発生を避けてください。このステップの終わりに、混合物は半透明でなければなりません。 混合物が半透明になるように均一に混合したら、混合物を37°Cで4 mLのDMEM培地を含むチューブに移し、上下にピペッティングしてガラスピペットで均質化します。 細胞播種セルを数えます。溶液中のニューロンの数は、標準的な実験室手順に従って数えることができる。注:抗体検出とカルシウム活性のイメージング実験では、3.5 cmディッシュあたり50,000細胞の濃度が最適です。 細胞を懸濁したまま、計算された容量を取り出し、PLLコーティングされたカバーガラスを含む3.5cmディッシュまたはPLLコーティングされたガラス底ディッシュにプレートします。 交差した動き(前後、次に左右、必要に応じて繰り返す)で静かに振ってセルを皿に均等に分配し、皿をCO2 (5%)インキュベーターに入れます。注意: 細胞が皿の周辺に落ち着くのを避けるために、交差した動きを使用することが重要です。 毎週、約1 mLのNB + B27を追加して、培養物が乾かないようにします。注:2週間後(in vitro [div]で14日間)、ニューロンは成熟し、実験に使用するすべての因子を発現します。このプロトコルを使用して得られたニューロンの総平均数は、妊娠中のラットあたり平均12個のE18胚に由来する約2.5 x 106 個のニューロンである。    パート2:神経細胞表面タンパク質の抗体検出のための海馬神経培養の使用 注:プロトコルのこの部分は、海馬培養を使用して、抗NMDAR脳炎患者の血清および/またはCSF中の抗NMDAR抗体を特定する方法を示しています。蛍光免疫染色は、生きたニューロンの反応性を視覚化するために使用されますが、他の視覚化方法も使用できます。この実験の適切な対照は、健康な個体からの血清またはCSFであろう。ヒトサンプルを使用する場合は、機関倫理委員会の承認が必要な場合があることに注意してください。 3. 生蛍光免疫染色 カバーガラスで成長した14個のdivセルを使用します(5つのカバーガラスを含む3.5cmの皿あたり50,000個のセル)。 フードの内側で、37°Cに予熱したNBでカバーガラスをすすぎます。 この場合、血清の場合は1:200、CSFの場合は1:2でNB培地で希釈した抗NMDAR抗体(一次抗体として使用)を含むサンプルを追加し、37°Cで1時間インキュベートします(CO2 (5%)インキュベーター内)。 RTでPBS3xで慎重にすすいでください。 固定液(PBS中の4%ホルムアルデヒド)を加え、RTで5分間インキュベートします。注意: 4%ホルムアルデヒドを取り扱うときは、フード内で作業し、推奨される個人用保護具を着用してください。 PBSで3回ずつ5分間洗浄します。 二次抗体ヤギ抗ヒトAF488を1:1000希釈で添加し、RTで1時間インキュベートします。注意: インキュベーション中は、アルミホイルで覆って光にさらされないようにしてください。 PBSで3回ずつ5分間洗浄します。蒸留水ですすぐ カバーガラスを液体封入剤(DAPIを使用した退色防止封入剤など、約7μL)で取り付け、残っている液体を吸引し、蒸留水ですすいでください。これで、ニューロンは蛍光イメージングの準備が整いました。注意: 封入剤を取り扱うときは、推奨される個人用保護具を着用してください。     パート3:カルシウムイメージングを用いた抗体病原性効果の実証 注:プロトコルのこの部分は、患者の抗体が培養物に機能的な影響を及ぼし、病原性を示唆しているかどうかを判断する方法を示しています。効果の重要性を高めるために、8人の患者からのCSFのプールが使用されました。生培養物のカルシウム活性は、GECI蛍光カルシウム指示薬(GCaMP5G)を用いて化学刺激(NMDA+グリシン)で記録した。これらの研究では、ニューロンの必要な生理学的条件を維持できる細胞室を備えた倒立蛍光顕微鏡が必要です。 4. カルシウムイメージング カバーガラスで成長した14〜18個のdivセルを使用します(5つのカバーガラスで3.5 cmの皿あたり50,000セル) イメージングの1週間前に、ウイルスベクターpAAV2-CAG-GCaMP5Gを2.5 x 1010 GC / mLで細胞に加え、5〜7日間インキュベートします。注:この市販のパッケージ済みAAV血清型2ベクターは、CAGプロモーター下で遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターGCaMP5Gを過剰発現します。 イメージングの1日前に、患者サンプル(この例では、NB + B27で1:25に希釈したCSFのプール)を追加し、24時間インキュベートします。汚染を避けるために、使用前に必ず人間のサンプル(0.2 μmの細孔サイズ)をろ過してください。注:これらの研究では、健康な被験者からのコントロールCSFを並行して実行する必要があります。 イメージング当日、イメージングセットアップを準備し、顕微鏡セルチャンバーを37°Cに設定し、レーンに蒸留水を満たし、5%CO2 を注入して細胞の生理学的状態を維持します。 フード内で、ステップ3の細胞を37°Cに予熱した3 mLのEPSで洗浄します。 細胞を2.45 mLのEPSで覆い、顕微鏡細胞チャンバーに移します。NBQX(10 μM)を追加してAMPA受容体とKA受容体をブロックし、NMDA受容体応答のみを視覚化します。 水銀灯とFITCフィルターキューブを備えた倒立蛍光顕微鏡で、100ms毎にフレームが記録された2分間の動画を取得します(自発活動)。注:20x NA 0.75エア対物レンズを使用し、画像(512 x 512ピクセル、16ビットグレースケール)をsCMOSカメラで100ミリ秒ごとに撮影しました。 100ms毎にフレームを記録した4分の2本目の動画を撮影。取得を開始した直後に、刺激溶液(NMDA [100 μM] + グリシン[1 μM])を皿に加えます。注意: ディッシュに培地を追加すると乱流が発生し、イメージング条件(フォーカス、蛍光強度、および/または非特異的バックグラウンドシグナル)が乱れる可能性があります。このような変化の可能性を減らすために、充填された2.5 mLディッシュに50 μLを超える溶液を追加しないでください。. 画像処理ソフトウェア(ここではImageJを使用した)を使用して、刺激時に得られた経時的な蛍光シグナルを、患者および対照CSFサンプルと共にインキュベートした培養物から抽出する。注:GCaMPプローブは、遊離カルシウムイオンに結合すると、立体構造が変化して明るくなります。したがって、蛍光強度の増加は、ニューロンの脱分極によるカルシウム流入と相関する。 分析する関心領域 (ROI) を決定します。ニューロンのソーマを手動でセグメント化し、ROIマネージャーにROIを追加します(ROIマネージャー>>ツールの分析>追加)。ROIマネージャーメニューからROIを保存します(詳細>保存)。 測定値を設定し(測定値を分析>設定)、[ 平均グレー値]を選択します。「 詳細>マルチメジャー」をクリックして細胞ソーマから平均蛍光強度プロファイルを抽出し、生成されたテーブルを.xlsスプレッドシートとして保存します。 統計解析を実行して、グループ間の蛍光を比較します(患者のCSFとコントロールのCSF)。