Culturas neuronais hipocampais para detectar e estudar novos anticorpos patogênicos envolvidos em encefalite autoimune

Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética local da Universidade de Barcelona seguindo regulamentos europeus (2010/63/UE) sobre o uso e cuidado de animais experimentais. O consentimento por escrito foi obtido dos pacientes, e o estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional local para o uso de amostras humanas (Hospital Clínic, HCB/2018/0192). NOTA: Há três partes no protocolo atual. A primeira é para estabelecer as culturas neuronais, a segunda é para a detecção de anticorpos superficiais usando culturas vivas de neurônios, e a terceira é determinar a patogenicidade desses anticorpos. PARTE 1: Estabelecimento de culturas neuronais hipocampais dissociadas, fetais e roedores 1. Etapas preparatórias Revestimento poli-L-lysine das superfícies de revestimento (3 dias antes da dissecação)Prepare o tampão de borate adicionando 2,38 g de ácido bórico e 1,27 g de bórax a 500 mL de água destilada e mexendo por 15 minutos até dissolver. Sob um capô, esterilize a solução tampão filtrando (tamanho de poros de 0,2 μm), etiqueta e armazenar à temperatura ambiente (RT).NOTA: Esta solução é estável e pode ser usada por 6 meses.ATENÇÃO: Ao preparar o tampão de borate, use equipamentos de proteção individual recomendados. Prepare a solução de estoque Poly-L-Lysine (PLL) (100 mg/mL) adicionando 1 g de PLL a 10 mL de água destilada e mexendo até dissolver. Prepare 500 alíquotas μL da solução de estoque PLL. Para alcançar uma concentração final de 1 mg/mL, adicione 500 μL de alíquota PLL a 50 mL de tampão de borate e redemoinho até dissolver, e esterilizar a solução filtrando (tamanho de poros de 0,2 μm).NOTA: Esta solução é estável e pode ser usada por 6 meses. Prepare as superfícies para revestimento. Use tampas de 12 mm de diâmetro para procedimentos de imunossuagem e pratos de fundo de vidro para estudos que incluirão a imagem de neurônios vivos. Se usar tampas, autoclave e, em seguida, coloque cinco tampas em cada prato (3,5 cm de diâmetro).NOTA: A espessura do deslizamento afeta a qualidade e intensidade do sinal das imagens adquiridas. A maioria dos objetivos do microscópio são projetados para deslizamentos de cobertura #1.5. Escolha as tampas apropriadas de acordo com a configuração e técnicas de imagem. Sob um capô, adicione 1,5 mL de solução PLL a cada prato (prato de fundo de vidro ou prato de 3,5 cm com cinco tampas). Certifique-se de que todas as tampas estão submersas e armazenadas em RT por 24 horas. 2 dias antes da dissecção, aspire a solução PLL e lave com água endotoxina estéril, certificando-se de que as tampas estão submersas. Mantenha a água nos pratos e guarde na RT por 24 horas. 1 dia antes da dissecação, aspire a água e substitua-a por mídia cultural NB + B27 (veja abaixo), e coloque os pratos em uma incubadora a 37 °C por 24 h. Preparação de mídia cultural e solução de estoque (1 dia antes da dissecação)Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM): A 500 mL de DMEM High Glicose (4,5 g/L) sem L-Glutamina e vermelho fenol, adicionar 50 mL de soro de cavalo, 50 mL de soro bovino fetal (FBS), 10 mL de L-glutamina (200 mM), 10 mL de piruvato de sódio (100 mM), 10 mL de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Filtrar (tamanho de poros de 0,2 μm) e armazenar em alíquotas de 5 mL a 4 oC com uma tampa bem fechada.NOTA: Esta solução é estável e pode ser usada por 1 mês. Neurobásal (NB) médio suplementado com B27 (NB + B27): A 50 mL de meio NB sem vermelho fenol, adicione 1 mL de suplemento B27. Hibernar-E médio suplementado com B27 (Hibernar + B27): A 50 mL de meio Hibernar-E, adicione 1 mL de suplemento B27. Solução Fisiológica Extracelular (EPS): A 1 L de água estéril, adicione o seguinte nas concentrações finais especificadas: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glicose (20 mM) e CaCl2 (2 mM). Mexa até dissolver e ajuste o pH para 7,4 adicionando NaOH (0,5 M) ou HCl (0,5 M). Sob o capô, esterilize filtrando (tamanho de poros de 0,2 μm) e armazene a 4 oC. Equipamentos e outros materiais de laboratório (dia de dissecção)Coloque um banho de água para 37 °C. Aqueça as seguintes alíquotas: 50 mL de HBSS e 5 mL de DMEM. Esterilize as seguintes ferramentas, imerso em um béquer contendo etanol absoluto (Figura 1B): fórceps, fórceps curvos, tesouras curvadas, fórceps finos, tesouras de cirurgia, fórceps de ângulo fino e tesoura de mola de precisão.NOTA: Para proteger as ferramentas, coloque um material macio (por exemplo, lenços de precisão científica) na parte inferior do béquer. Encha duas bandejas com gelo e coloque os seguintes itens.Bandeja de gelo 1 (Figura 1C): Coloque ferramentas cirúrgicas no béquer com etanol absoluto, um béquer com HBSS para enxaguar as ferramentas cirúrgicas, um prato de 10 cm com HBSS para colocar os embriões, um prato de 6 cm com HBSS para colocar as cabeças dos embriões, e um prato de 6 cm com Hibernate + B27 para colocar os cérebros dos embriões. Bandeja de gelo 2: Coloque uma alíquota de 1 mL de trippsina 2,5% e um prato de 3,5 cm com Hibernar + B27 para o hipocampo dissecado.NOTA: O tempo necessário para este procedimento depende da experiência do investigador e do número de embriões a serem dissecados. Portanto, o gelo deve permanecer congelado pelo tempo necessário. Bandejas de poliestireno são recomendadas para este fim. 2. Dissecção e semeadura (Figura 1) Isolamento hipocampalNOTA: Ratos gestantes com embriões no E18 são eutanizados imediatamente antes do início do protocolo de acordo com o comitê de ética local da Universidade de Barcelona, seguindo regulamentos europeus (2010/63/UE) sobre o uso e cuidado de animais experimentais. Neste protocolo, a inalação de dióxido de carbono (CO2) foi utilizada como método de eutanásia.Disseca o rato ao nível do peritônio abdominal usando fórceps e tesouras. Extrair o útero com os embriões E18 e colocá-lo em um prato de 10 cm que foi refrigerado no gelo.NOTA: É importante evitar que os pelos de rato se anexem aos embriões. Recomenda-se o uso de quantidades abundantes de 70% de etanol para esterilizar o abdômen. A partir deste passo em diante, trabalhe dentro do capô na bandeja de gelo 1. Abra os sacos embrionários e transfira os embriões para o prato de 10 cm com HBSS, certificando-se de que os embriões estejam totalmente imersos. Retire a cabeça do embrião com uma tesoura e coloque-a no prato de 6 cm com HBSS. Repita este processo com todos os embriões.NOTA: Para evitar contaminação, todos os tecidos, exceto as cabeças de embrião, devem ser descartados em um recipiente com tampa de parafuso. Segure a cabeça do embrião com fórceps finos e perfure as órbitas com um par de fórceps finos, entrando em um ângulo de 45° e, em seguida, solte os fórceps finos.NOTA: Os fórceps não devem passar pelo cérebro, por isso é importante manter o ângulo ao entrar. Dissecar a pele e o crânio com a tesoura da cirurgia, desde o osso occipital até o osso frontal. Remova o cérebro com um par de fórceps finos e coloque-o no prato de 6 cm com Hibernar + B27. Repita este processo até que todos os cérebros sejam recuperados. Separar os teleencefalos com os fórceps finos.NOTA: A partir deste passo em diante, a dissecção do hipocampo é realizada sob um estereótipo. Recomenda-se o uso de lâmpadas articuladas para que a luz ilumine a superfície de dissecção dos lados. Também é recomendado usar um fundo preto, pois isso proporciona mais contraste, permitindo distinguir melhor o hipocampo. Prepare um prato de 10 cm colocando gotas de Hibernar + B27 a distâncias de 1 cm (por exemplo, em círculo). Coloque um telencephalon por gota de Hibernar + B27 e visualize através do escopo de dissecação (recomenda-se ampliação objetiva de 1,25x). Descasque cuidadosamente as meninges e remova o tálamo para melhor visualizar o hipocampo. Disseca o hipocampo com a tesoura de mola de precisão e coloque-o no prato de 3,5 cm com Hibernar + B27 na bandeja de gelo 2. Repita para cada teleencefalo até que todos os hipocampos sejam coletados. Colete cuidadosamente todo o hipocampi com uma pipeta Pasteur e transfira-os para um tubo de 50 mL.NOTA: Tome o volume mínimo de Hibernar + B27 ao coletar o hipocampi para não diluir a trippsina. Dissociação celularDissociação enzimática do hipocampoNo tubo de 50 mL contendo o hipocampi, adicione 1 mL de trippsina de 2,5% e leve-o a um volume de 5 mL com HBSS. Incubar por 15 min no banho de água a 37 °C. Para diluir a trippsina, adicione 10 mL de HBSS pré-aquecido e incubar por 5 min no banho de água a 37 °C. Transfira o hipocampi que agora aparece como massa de muco para um tubo de 50 mL com uma micropipette de 1.000 μL, adicione 6 mL de HBSS pré-aquecido e incuba por 5 minutos no banho de água a 37 °C. Dissociação mecânica do hipocampoTransfira a massa para um tubo de 2 mL com fundo cônico, levando o volume mínimo. Adicione 1 mL de mídia DMEM pré-aquecida. Homogeneize a pelota com uma micropipette de 1.000 μL aspirando suavemente para cima e para baixo.NOTA: É fundamental evitar gerar bolhas ao aspirar, pois as bolhas podem lise as células. Repita a aspiração para cima e para baixo com uma pipeta de vidro pré-puxada (10x-20x), com sua ponta em contato com a parte inferior cônica do tubo. Evite gerar bolhas. No final desta etapa, a mistura deve ser translúcida. Uma vez misturado de forma homogênea, de tal forma que a mistura seja translúcida, transfira a mistura para um tubo contendo 4 mL de mídia DMEM a 37 °C e homogeneize com uma pipeta de vidro por pipetar para cima e para baixo. Semeadura celularConte as células. O número de neurônios na solução pode ser contado de acordo com procedimentos laboratoriais padrão.NOTA: Em experimentos de imagem para detecção de anticorpos e atividade de cálcio, uma concentração de 50.000 células por prato de 3,5 cm é ótima. Mantendo as células suspensas, retire o volume calculado e a placa em pratos de 3,5 cm contendo tampas revestidas de PLL ou nos pratos de fundo de vidro revestidos de PLL. Distribua uniformemente as células nos pratos tremendo suavemente em movimentos cruzados (para frente e para trás, depois lado a lado; repita conforme necessário) e coloque os pratos na incubadora de CO2 (5%)NOTA: É importante usar movimentos cruzados para evitar que as células se instalem na periferia do prato. Toda semana, adicione aproximadamente 1 mL de NB + B27, para que a cultura não seque.NOTA: Após 2 semanas (14 dias in vitro [div]), os neurônios são maduros e expressam todos os fatores a serem usados para experimentação. O número médio total de neurônios obtidos usando este protocolo é de aproximadamente 2,5 x 106 neurônios provenientes de uma média de 12 embriões E18 por rato grávida.    PARTE 2: Utilização de culturas neuronais hipocampais para detecção de anticorpos em proteínas da superfície celular neuronal NOTA: Esta parte do protocolo demonstra como culturas hipocampais são usadas para identificar anticorpos anti-NMDAR no soro e/ou CSF de pacientes com encefalite anti-NMDAR. A imunossuagem fluorescente é usada para visualizar a reatividade nos neurônios vivos, mas outros métodos de visualização também podem ser usados. Um controle apropriado para este experimento seria soro ou CSF de um indivíduo saudável. Ao usar amostras humanas, tenha em mente que a aprovação do comitê de ética institucional pode ser necessária. 3. Imunostaining fluorescente ao vivo Use 14 células div que foram cultivadas em deslizamentos de cobertura (50.000 células por prato de 3,5 cm contendo cinco tampas). Dentro do capô, enxágue as tampas com NB pré-aquecido a 37 °C. Adicione a amostra que neste caso contém anticorpos anti-NMDAR (usados como anticorpo primário) diluídos em mídia NB às 1:200 para soro ou 1:2 para CSF e incubar 1 h a 37 °C (dentro da incubadora de CO2 (5%). Enxágüe cuidadosamente com PBS 3x em RT. Adicione a solução de fixação (4% de formaldeído em PBS) e incubar em RT por 5 min.ATENÇÃO: Ao manusear 4% de formaldeído, trabalhe dentro do capô e use equipamentos de proteção individual recomendados. Lave 3x com PBS por 5 min cada. Adicione anticorpo secundário Anti-Humano AF488 a 1:1000 diluição e incubar na RT por 1 h.NOTA: Durante a incubação, proteja-se da exposição à luz cobrindo com papel alumínio. Lave 3x com PBS por 5 min cada. Enxágüe com água destilada Monte as tampas com um meio de montagem líquida (por exemplo, mídia de montagem antifrápida com DAPI; aproximadamente 7 μL), aspire qualquer líquido restante e enxágue com água destilada. Os neurônios estão prontos para a fluorescência.ATENÇÃO: Ao manusear o meio de montagem, use o equipamento de proteção individual recomendado.     PARTE 3: Demonstração de efeitos patogênicos de anticorpos usando imagem de cálcio NOTA: Esta parte do protocolo demonstra como determinar se os anticorpos em pacientes têm um efeito funcional sobre as culturas, o que sugere patogenicidade. Para aumentar a significância dos efeitos, utilizou-se um pool de CSF de oito pacientes. A atividade de cálcio das culturas vivas foi registrada mediante estimulação química (NMDA + Glycine) utilizando o indicador de cálcio de fluorescência GECI (GCaMP5G). Estes estudos requerem um microscópio de fluorescência invertida com uma câmara celular que pode manter as condições fisiológicas necessárias dos neurônios. 4. Imagem de cálcio Use células div de 14 a 18 que foram cultivadas em deslizamentos de cobertura (50.000 células por prato de 3,5 cm com cinco tampas) 1 semana antes da imagem, adicione o vetor viral pAAV2-CAG-GCaMP5G a 2,5 x 1010 GC/mL às células e incubar por 5-7 dias.NOTA: Este sorotipo AAV pré-embalado, pré-embalado, sobre-expressa o indicador de cálcio geneticamente codificado GCaMP5G sob um promotor cag. 1 dia antes da imagem, adicione a amostra do paciente (neste exemplo, um pool de CSF diluído 1:25 em NB + B27) e incubar por 24 h. Filtrar sempre amostras humanas (0,2 μm de tamanho de poros) antes de ser usado para evitar contaminação.NOTA: Para esses estudos, o controle do CSF de indivíduos saudáveis precisa ser executado em paralelo. No dia da imagem, prepare a configuração da imagem e coloque a câmara celular do microscópio para 37 °C, encha a pista com água destilada e infundir com 5% de CO2 para manter as condições fisiológicas celulares. No capô, lave as células do Passo 3 com 3 mL de EPS pré-aquecido a 37 °C Cubra as células com 2,45 mL de EPS e transfira-as para a câmara celular do microscópio. Adicione NBQX (10 μM) para bloquear os receptores AMPA e KA para visualizar exclusivamente a resposta do receptor NMDA. No microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lâmpada de mercúrio e um cubo de filtro FITC, adquira um filme de 2 minutos com quadros gravados a cada 100 ms (atividade espontânea).NOTA: Um objetivo de ar 20x NA 0,75 foi usado, e imagens (512 x 512 pixels, escala de cinza de 16 bits) foram tiradas a cada 100 ms com uma câmera sCMOS. Adquira o segundo filme de 4 minutos com quadros gravados a cada 100 ms. Logo após o início da aquisição, adicione a solução de estimulação (NMDA [100 μM] + Glycine [1 μM]) ao prato.NOTA: A adição de mídia no prato gerará turbulência que pode interromper as condições de imagem (foco, intensidade de fluorescência e/ou sinal de fundo inespecífico). Não adicione mais de 50 μL de solução no prato cheio de 2,5 mL para diminuir a probabilidade de tais alterações. Utilizando-se o software de processamento de imagens (ImageJ foi utilizado aqui), extrair o sinal de fluorescência ao longo do tempo, obtido após a estimulação, a partir das culturas incubadas com o paciente e controlar amostras de CSF.NOTA: As sondas GCaMP, ao se ligarem a íons de cálcio livres, sofrem uma mudança conformacional fazendo com que fiquem mais brilhantes. Portanto, o aumento da intensidade da fluorescência se correlaciona com um influxo de cálcio devido à despolarização neuronal. Determine as regiões de interesse (ROI) para analisar. Segmente manualmente as somas dos neurônios e adicione os ROIs ao gerenciador de ROI (Analisar ferramentas > > gerente de ROI > Add). Salve o ROI do menu ROI Manager (Mais > Salvar). Defina as medidas (Analisar > definir medidas) e selecione o valor cinza Médio. Extrair o perfil médio de intensidade de fluorescência das somas celulares clicando em Mais > Multi Medida e, em seguida, salve a tabela gerada como uma planilha .xls. Realizar análises estatísticas para comparar a fluorescência entre grupos (CSF vs. control’s CSF dos pacientes).