Культуры нейронов гиппокампа для обнаружения и изучения новых патогенных антител, участвующих в аутоиммунном энцефалите

Все процедуры были одобрены местным комитетом по этике Университета Барселоны в соответствии с европейскими (2010/63/UE) правилами об использовании и уходе за экспериментальными животными. Письменное информированное согласие было получено от пациентов, и исследование было одобрено местным институциональным наблюдательным советом для использования образцов человека (Hospital Clínic, HCB/2018/0192). ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол состоит из трех частей. Первый – для установления нейронных культур, второй – для обнаружения поверхностных антител с использованием живых культур нейронов, а третий – для определения патогенности этих антител. ЧАСТЬ 1: Создание диссоциированных, фетальных, грызунов гиппокампальных нейронных культур 1. Подготовительные этапы Поли-L-лизиновое покрытие поверхностей покрытия (за 3 дня до рассечения)Подготовьте боратный буфер, добавив 2,38 г борной кислоты и 1,27 г буры в 500 мл дистиллированной воды и помешивая в течение 15 мин до растворения. Под капотом стерилизуют буферный раствор путем фильтрации (размер пор 0,2 мкм), этикетки и хранят при комнатной температуре (RT).ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 6 месяцев.ВНИМАНИЕ: При приготовлении боратного буфера надевайте рекомендуемые средства индивидуальной защиты. Приготовьте раствор поли-L-лизина (ФАПЧ) (100 мг/мл), добавив 1 г ФАПЧ к 10 мл дистиллированной воды и перемешивая до растворения. Приготовьте 500 мкл аликвот складского раствора ФАПЧ. Чтобы достичь конечной концентрации 1 мг/мл, добавляют 500 мкл аликвоты ФАПЧ к 50 мл боратного буфера и закручивают до растворения и стерилизуют раствор путем фильтрации (размер пор 0,2 мкм).ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 6 месяцев. Подготовьте поверхности к покрытию. Используйте чехлы диаметром 12 мм для процедур иммуноокрашения и посуду со стеклянным дном для исследований, которые будут включать визуализацию живых нейронов. При использовании чехлов, автоклавируйте, а затем поместите пять обложек в каждое блюдо (диаметр 3,5 см).ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина обшивки влияет на качество и интенсивность сигнала полученных изображений. Большинство объективов микроскопа рассчитаны на крышки No1.5. Выберите подходящие обшивки в соответствии с настройкой и методами визуализации. Под капюшоном добавьте 1,5 мл раствора ФАПЧ в каждое блюдо (блюдо со стеклянным дном или блюдо размером 3,5 см с пятью крышками). Убедитесь, что все крышки погружены в воду и хранятся в RT в течение 24 часов. За 2 дня до рассечения аспирировать раствор ФАПЧ и промыть стерильной водой без эндотоксинов, убедившись, что крышки погружены в воду. Держите воду в посуде и храните в RT в течение 24 ч. За 1 день до рассечения аспирировать воду и заменить ее питательной средой NB + B27 (см. ниже), а посуду поместить в инкубатор при 37 °C в течение 24 ч. Приготовление культуральной среды и стоковой раствора (за 1 день до вскрытия)Модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM): До 500 мл DMEM High Glucose (4,5 г / л) без L-глутамина и фенола красного, добавьте 50 мл лошадиной сыворотки, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мл L-глутамина (200 мМ), 10 мл пирувата натрия (100 мМ), 10 мл пенициллина-стрептомицина (10 000 Ед / мл). Фильтровать (размер пор 0,2 мкм) и хранить в аликвотах по 5 мл при 4 oC с плотно закрытым колпачком.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 1 месяца. Нейробазальная (NB) среда, дополненная B27 (NB + B27): К 50 мл среды NB без фенольного красного цвета, добавьте 1 мл добавки B27. Среда Hibernate-E, дополненная B27 (Hibernate + B27): К 50 мл среды Hibernate-E добавьте 1 мл добавки B27. Внеклеточный физиологический раствор (EPS): к 1 л стерильной воды добавляют следующее в указанных конечных концентрациях: NaCl (140 мМ), KCl (3,5 мМ), HEPES (10 мМ), глюкозу (20 мМ) и CaCl2 (2 мМ). Перемешайте до растворения и отрегулируйте рН до 7,4, добавив NaOH (0,5 М) или HCl (0,5 М). Под капотом стерилизуют фильтрацией (размер пор 0,2 мкм) и хранят при 4 oC. Оборудование и другие лабораторные материалы (день вскрытия)Установите водяную баню при температуре 37 °C. Нагрейте следующие аликвоты: 50 мл HBSS и 5 мл DMEM. Стерилизуйте следующие инструменты, погружаясь в стакан, содержащий абсолютный этанол (рисунок 1B): щипцы, изогнутые щипцы, ножницы, тонко изогнутые щипцы, тонкие прямые щипцы, хирургические ножницы, тонкоугольные щипцы и прецизионные пружинные ножницы.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы защитить инструменты, поместите мягкий материал (например, научные прецизионные салфетки) в нижней части стакана. Заполните два лотка льдом и поместите следующие предметы.Лоток для льда 1 (Рисунок 1C): Поместите хирургические инструменты в стакан с абсолютным этанолом, стакан с HBSS для полоскания хирургических инструментов, 10-сантиметровую посуду с HBSS для размещения эмбрионов, 6-сантиметровую чашку с HBSS для размещения головок эмбрионов и 6-сантиметровую чашку с Hibernate + B27 для размещения мозга эмбрионов. Лоток для льда 2: Поместите 1 мл аликвоты трипсина 2,5% и блюдо 3,5 см с Hibernate + B27 для рассеченного гиппокампа.ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для этой процедуры, зависит от опыта исследователя и количества эмбрионов, подлежащих вскрытию. Поэтому лед должен оставаться замороженным в течение необходимого количества времени. Для этой цели рекомендуются полистирольные лотки. 2. Рассечение и посев (рисунок 1) Изоляция гиппокампаПРИМЕЧАНИЕ: Беременные крысы с эмбрионами в E18 подвергаются эвтаназии непосредственно перед началом протокола в соответствии с местным комитетом по этике Университета Барселоны, следуя европейским (2010/63/UE) правилам об использовании и уходе за экспериментальными животными. В этом протоколе в качестве метода эвтаназии использовалось вдыхание углекислого газа (CO2).Рассекните крысу на уровне брюшины живота с помощью щипцов и ножниц. Извлеките матку с эмбрионами E18 и поместите ее в 10-сантиметровую посуду, которая была охлаждена на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать прикрепления волос крыс к эмбрионам. Рекомендуется использовать обильное количество 70% этанола для стерилизации живота. Начиная с этого шага, работайте внутри капота на лотке для льда 1. Откройте эмбриональные мешочки и перенесите эмбрионы в 10-сантиметровую чашку с HBSS, убедившись, что эмбрионы полностью погружены. Снимите головку эмбриона ножницами и поместите ее в 6-сантиметровую посуду с HBSS. Повторите этот процесс со всеми эмбрионами.ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнения все ткани, за исключением эмбриональных головок, должны быть выброшены в контейнер с винтовой крышкой. Удерживайте головку эмбриона тонко изогнутыми щипцами и прокалывайте орбиты парой тонко-прямых щипцов, входящих под углом 45°, а затем выпускают тонко изогнутые щипцы.ПРИМЕЧАНИЕ: Щипцы не должны проходить через мозг, поэтому важно поддерживать угол при входе. Рассекните кожу и череп хирургическими ножницами, начиная от затылочной кости до лобной кости. Удалите мозг парой тонко изогнутых щипцов и поместите его в 6-сантиметровую тарелку с Hibernate + B27. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все мозги не будут восстановлены. Стрельцы разделяют теленцефалоны тонкими прямыми щипцами.ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, рассечение гиппокампа проводится под стереомикроскопом. Рекомендуется использовать шарнирно-сочлененные лампы так, чтобы свет освещал поверхность рассечения с боков. Также рекомендуется использовать черный фон, так как это обеспечивает большую контрастность, позволяя лучше различать гиппокамп. Приготовьте блюдо размером 10 см, поместив капли Hibernate + B27 на расстояние 1 см (например, по кругу). Поместите один теленцефалон на каплю Hibernate + B27 и визуализируйте через рассекающий прицел (рекомендуется 1,25-кратное объективное увеличение). Тщательно очистите мозговые оболочки и удалите таламус, чтобы лучше визуализировать гиппокамп. Рассекните гиппокамп прецизионными пружинными ножницами и поместите его в тарелку размером 3,5 см с Hibernate + B27 в лотке для льда 2. Повторяйте для каждого теленцефалона до тех пор, пока не будут собраны все гиппокампы. Аккуратно соберите все гиппокампы пипеткой Пастера и переложите их в трубку объемом 50 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите минимальный объем Hibernate + B27 при сборе гиппокампа, чтобы не разбавлять трипсин. Диссоциация клетокФерментативная диссоциация гиппокампаВ трубку объемом 50 мл, содержащую гиппокамп, добавьте 1 мл 2,5% трипсина и доведите его до объема 5 мл с HBSS. Инкубировать в течение 15 мин на водяной бане при 37 °C. Чтобы разбавить трипсин, добавляют 10 мл предварительно нагретого HBSS и инкубируют в течение 5 мин на водяной бане при 37 °C. Перенесите гиппокампы, которые теперь выглядят как слизевая масса, в трубку объемом 50 мл с микропипеткой 1000 мкл, добавьте 6 мл предварительно нагретого HBSS и инкубируйте в течение 5 минут на водяной бане при 37 °C. Механическая диссоциация гиппокампаПереложите массу на трубку объемом 2 мл с коническим дном, взяв минимальный объем. Добавьте 1 мл предварительно нагретой среды DMEM. Гомогенизируйте гранулу микропипеткой объемом 1000 мкл, осторожно аспирируя вверх и вниз.ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать образования пузырьков при аспирации, так как пузырьки могут лизировать клетки. Повторите аспирацию вверх и вниз с помощью предварительно вытянутой стеклянной пипетки (10x-20x), с ее наконечником, соприкасающимся с коническим дном трубки. Избегайте образования пузырьков. В конце этого этапа смесь должна быть полупрозрачной. После однородного смешивания таким образом, чтобы смесь была полупрозрачной, переложите смесь в трубку, содержащую 4 мл среды DMEM при 37 °C, и гомогенизируйте стеклянной пипеткой путем пипетки вверх и вниз. Посев клетокПодсчитайте ячейки. Количество нейронов в растворе можно подсчитать в соответствии со стандартными лабораторными процедурами.ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах по визуализации для обнаружения антител и активности кальция концентрация 50 000 клеток на чашку размером 3,5 см является оптимальной. Удерживая ячейки во взвешенном состоянии, извлеките расчетный объем и тарелку в посуду размером 3,5 см, содержащую покрытые ФАПЧ крышки, или в стеклянную посуду со стеклянным дном, покрытую ФАПЧ. Равномерно распределите клетки по посуде, мягко встряхивая в перекрестных движениях (вперед и назад, затем из стороны в сторону; повторяйте по мере необходимости) и поместите посуду в инкубатор CO2 (5%).ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать перекрестные движения, чтобы избежать оседания клеток на периферии тарелки. Каждую неделю добавляйте примерно 1 мл NB+B27, чтобы культура не высохла.ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2 недели (14 дней in vitro [div]) нейроны созревают и выражают все факторы, которые будут использоваться для экспериментов. Общее среднее число нейронов, полученных с помощью этого протокола, составляет примерно 2,5 х 106 нейронов, поступающих в среднем из 12 эмбрионов E18 на беременную крысу.    ЧАСТЬ 2: Использование культур нейронов гиппокампа для обнаружения антител в белках поверхности нейронных клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола демонстрирует, как культуры гиппокампа используются для идентификации антител против NMDAR в сыворотке и / или CSF пациентов с анти-NMDAR энцефалитом. Флуоресцентное иммуноокрашивание используется для визуализации реактивности в живых нейронах, но также могут быть использованы другие методы визуализации. Подходящим контролем для этого эксперимента будет сыворотка или ликвор от здорового человека. При использовании человеческих образцов имейте в виду, что может потребоваться одобрение институционального этического комитета. 3. Живое флуоресцентное иммуноокрашивание Используйте 14 div-клеток, которые были выращены на крышках (50 000 клеток на блюдо размером 3,5 см, содержащее пять обложек). Внутри вытяжки промойте крышки с предварительным нагретым до 37 °C NB. Добавьте образец, который в этом случае содержит анти-NMDAR антитела (используемые в качестве первичного антитела), разведенные в среде NB при 1:200 для сыворотки или 1:2 для CSF и инкубируем 1 ч при 37 °C (внутри инкубатора CO2 (5%) Тщательно смойте PBS 3x на RT. Добавьте раствор для фиксации (4% формальдегид в PBS) и инкубируйте на RT в течение 5 мин.ВНИМАНИЕ: При обращении с 4% формальдегидом работайте внутри капота и носите рекомендуемые средства индивидуальной защиты. Мойте 3x с PBS в течение 5 минут каждый. Добавьте вторичное антитело Goat anti-Human AF488 в разведении 1:1000 и инкубируйте при RT в течение 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации защитите от воздействия света, покрыв алюминиевой фольгой. Мойте 3x с PBS в течение 5 минут каждый. Промыть дистиллированной водой Установите крышки с помощью жидкой монтажной среды (например, антивядающего монтажного носителя с DAPI; приблизительно 7 мкл), аспирируйте любую оставшуюся жидкость и промойте дистиллированной водой. Нейроны теперь готовы к флуоресцентной визуализации.ВНИМАНИЕ: При обращении со монтажной средой носите рекомендуемые средства индивидуальной защиты.     ЧАСТЬ 3: Демонстрация патогенных эффектов антител с помощью визуализации кальция ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола демонстрирует, как определить, оказывают ли антитела у пациентов функциональное влияние на культуры, что предполагает патогенность. Для того, чтобы повысить значимость эффектов, был использован пул ликвора от восьми пациентов. Кальциевая активность живых культур регистрировалась при химической стимуляции (NMDA + глицин) с использованием индикатора кальция флуоресценции GECI (GCaMP5G). Эти исследования требуют инвертированного флуоресцентного микроскопа с клеточной камерой, которая может поддерживать необходимые физиологические условия нейронов. 4. Визуализация кальция Используйте 14-18 div-клеток, которые были выращены на покровных листах (50 000 клеток на тарелку размером 3,5 см с пятью крышками) За 1 неделю до визуализации добавьте вирусный вектор pAAV2-CAG-GCaMP5G в 2,5 x 1010 ГК/мл к клеткам и инкубируйте в течение 5-7 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот коммерчески доступный, предварительно упакованный вектор серотипа AAV 2 чрезмерно экспрессирует генетически закодированный индикатор кальция GCaMP5G под промотором CAG. За 1 день до визуализации добавляют образец пациента (в этом примере пул ликвора разбавляют 1:25 в NB + B27) и инкубируют в течение 24 ч. Всегда фильтруйте образцы человека (размер пор 0,2 мкм) перед использованием, чтобы избежать загрязнения.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих исследований контроль ликвора от здоровых субъектов должен проводиться параллельно. В день визуализации подготовьте установку визуализации и установите клеточную камеру микроскопа на 37 ° C, заполните полосу дистиллированной водой и вливайте 5% CO2 для поддержания физиологических условий клеток. В вытяжке вымойте ячейки с шага 3 с 3 мл EPS, предварительно нагретой до 37 °C Накройте клетки 2,45 мл EPS и перенесите их в камеру микроскопа. Добавьте NBQX (10 мкМ) для блокирования рецепторов AMPA и KA для визуализации исключительно ответа рецептора NMDA. В перевернутом флуоресцентном микроскопе, оснащенном ртутной лампой и кубом фильтра FITC, приобретите 2-минутный фильм с кадрами, записанными каждые 100 мс (спонтанная активность).ПРИМЕЧАНИЕ: Использовался 20-кратный воздушный объектив NA 0,75, а изображения (512 x 512 пикселей, 16-битные оттенки серого) делались каждые 100 мс с помощью камеры sCMOS. Приобретите второй фильм продолжительностью 4 минуты с кадрами, записанными каждые 100 мс. Вскоре после начала приема добавьте в блюдо стимулирующий раствор (NMDA [100 мкМ] + глицин [1 мкМ]).ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление среды в тарелку создаст турбулентность, которая может нарушить условия визуализации (фокус, интенсивность флуоресценции и / или неспецифический фоновый сигнал). Не добавляйте более 50 мкл раствора в заполненную тарелку объемом 2,5 мл, чтобы уменьшить вероятность таких изменений. Используя программное обеспечение для обработки изображений (здесь использовался ImageJ), извлекайте флуоресцентный сигнал с течением времени, полученный при стимуляции, из культур, инкубированных с пациентом, и контролируйте образцы ликвора.ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды GCaMP при связывании со свободными ионами кальция претерпевают конформационные изменения, заставляя их становиться ярче. Поэтому увеличение интенсивности флуоресценции коррелирует с притоком кальция из-за деполяризации нейронов. Определите интересующие регионы (ROI) для анализа. Вручную сегментируйте сомы нейронов и добавьте ROI в менеджер ROI (Анализ инструментов > > Менеджер окупаемости инвестиций > Добавить). Сохраните окупаемость инвестиций в меню диспетчера ROI (Подробнее > Сохранить). Задайте измерения (Analyze > Set measurements) и выберите значение Средний серый. Извлеките профиль средней интенсивности флуоресценции из ячейки somas, щелкнув Дополнительно > Multi Measure, а затем сохраните таблицу, созданную в виде .xls электронной таблице. Выполните статистический анализ для сравнения флуоресценции между группами (CSF пациентов и CSF контроля).