Cultures neuronales hippocampiques pour détecter et étudier de nouveaux anticorps pathogènes impliqués dans l’encéphalite auto-immune

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d’éthique local de l’Université de Barcelone conformément à la réglementation européenne (2010/63/UE) sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire. Le consentement éclairé écrit des patients a été obtenu et l’étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel local pour l’utilisation d’échantillons humains (Hospital Clínic, HCB/2018/0192). Remarque : Il y a trois parties dans le protocole actuel. Le premier est pour établir les cultures neuronales, le second est pour la détection d’anticorps de surface à l’aide de cultures vivantes de neurones, et le troisième est de déterminer la pathogénicité de ces anticorps. PARTIE 1 : Mise en place de cultures neuronales dissociées, fœtales et rongeurs hippocampiques 1. Étapes préparatoires Revêtement Poly-L-Lysine des surfaces de placage (3 jours avant la dissection)Préparer le tampon de borate en ajoutant 2,38 g d’acide borique et 1,27 g de borax à 500 mL d’eau distillée et en agitant pendant 15 minutes jusqu’à dissolution. Sous une hotte, stériliser la solution tampon en la filtrant (taille des pores de 0,2 μm), étiqueter et conserver à température ambiante (RT).REMARQUE: Cette solution est stable et peut être utilisée pendant 6 mois.ATTENTION : Lors de la préparation du tampon de borate, portez l’équipement de protection individuelle recommandé. Préparer la solution mère de Poly-L-Lysine (PLL) (100 mg/mL) en ajoutant 1 g de LPL à 10 mL d’eau distillée et en agitant jusqu’à dissolution. Préparer 500 μL aliquotes de solution mère de PLL. Pour atteindre une concentration finale de 1 mg/mL, ajouter 500 μL de LPL aliquote à 50 mL de tampon de borate et agiter jusqu’à dissolution et stériliser la solution par filtration (taille des pores de 0,2 μm).REMARQUE: Cette solution est stable et peut être utilisée pendant 6 mois. Préparez les surfaces pour le revêtement. Utilisez des lamelles de couverture de 12 mm de diamètre pour les procédures d’immunomarquage et des boîtes à fond de verre pour les études qui comprendront l’imagerie de neurones vivants. Si vous utilisez des lamelles de couverture, autoclaver puis placer cinq lamelles de couverture dans chaque plat (3,5 cm de diamètre).REMARQUE: L’épaisseur de la lamelle de couverture affecte la qualité et l’intensité du signal des images acquises. La plupart des objectifs de microscope sont conçus pour les lamelles de couverture #1.5. Choisissez les lamelles de couverture appropriées en fonction de la configuration et des techniques d’imagerie. Sous une hotte, ajouter 1,5 ml de solution de LPL à chaque plat (plat à fond de verre ou plat de 3,5 cm avec cinq lamelles de couverture). Assurez-vous que tous les feuillets de couverture sont immergés et stockés à RT pendant 24 h. 2 jours avant la dissection, aspirer la solution de LPL et laver à l’eau stérile exempte d’endotoxines, en s’assurant que les lamelles de couverture sont immergées. Gardez de l’eau dans la vaisselle et conservez à TA pendant 24 h. 1 jour avant la dissection, aspirer l’eau et la remplacer par des milieux de culture NB + B27 (voir ci-dessous), et placer les plats dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h. Préparation des milieux de culture et de la solution mère (1 jour avant la dissection)Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) : À 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose (4,5 g/L) sans L-glutamine et rouge de phénol, ajouter 50 mL de sérum de cheval, 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 10 mL de L-glutamine (200 mM), 10 mL de pyruvate de sodium (100 mM), 10 mL de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL). Filtrer (taille des pores de 0,2 μm) et conserver dans des aliquotes de 5 mL à 4 oC avec un bouchon hermétiquement fermé.REMARQUE: Cette solution est stable et peut être utilisée pendant 1 mois. Milieu neurobasal (NB) supplémenté en B27 (NB + B27) : À 50 mL de milieu NB sans rouge de phénol, ajouter 1 mL de supplément B27. Milieu Hibernate-E supplémenté en B27 (Hibernate + B27): À 50 mL de milieu Hibernate-E, ajouter 1 mL de supplément B27. Solution physiologique extracellulaire (EPS) : À 1 L d’eau stérile, ajouter ce qui suit aux concentrations finales spécifiées : NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glucose (20 mM) et CaCl 2 (2 mM). Remuer jusqu’à dissolution et ajuster le pH à 7,4 en ajoutant du NaOH (0,5 M) ou du HCl (0,5 M). Sous le capot, stériliser par filtration (taille des pores de 0,2 μm) et conserver à 4 oC. Équipement et autres matériaux de laboratoire (jour de la dissection)Réglez un bain-marie à 37 °C. Chauffer les aliquotes suivantes : 50 mL de HBSS et 5 mL de DMEM. Stériliser les outils suivants en les immergeant dans un bécher contenant de l’éthanol absolu (figure 1B) : pinces, pinces courbes, ciseaux, pinces à courbure fine, pinces droites fines, ciseaux chirurgicaux, pinces à angle fin et ciseaux à ressort de précision.REMARQUE : Pour protéger les outils, placez un matériau souple (p. ex., des lingettes de précision scientifique) au fond du bécher. Remplissez deux plateaux de glace et placez les éléments suivants.Bac à glace 1 (Figure 1C) : Placer des outils chirurgicaux dans le bécher avec de l’éthanol absolu, un bécher avec HBSS pour rincer les outils chirurgicaux, un plat de 10 cm avec HBSS pour placer les embryons, un plat de 6 cm avec HBSS pour placer les têtes des embryons, et un plat de 6 cm avec Hibernate + B27 pour placer le cerveau des embryons. Bac à glace 2 : Placer une partie aliquote de 1 mL de trypsine à 2,5 % et un plat de 3,5 cm avec Hibernate + B27 pour l’hippocampe disséqué.NOTE: Le temps nécessaire à cette procédure dépend de l’expérience de l’investigateur et du nombre d’embryons à disséquer. Par conséquent, la glace doit rester gelée pendant le temps nécessaire. Les plateaux en polystyrène sont recommandés à cet effet. 2. Dissection et ensemencement (figure 1) Isolement hippocampiqueREMARQUE: Les rates gravides avec des embryons à E18 sont euthanasiées immédiatement avant le début du protocole conformément au comité d’éthique local de l’Université de Barcelone, conformément à la réglementation européenne (2010/63 / UE) sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire. Dans ce protocole, l’inhalation de dioxyde de carbone (CO2) a été utilisée comme méthode d’euthanasie.Disséquez le rat au niveau du péritoine abdominal à l’aide de pinces et de ciseaux. Extrayez l’utérus avec les embryons E18 et placez-le dans un plat de 10 cm qui a été refroidi sur de la glace.NOTE: Il est important d’éviter les poils de rat qui se fixent aux embryons. Il est recommandé d’utiliser de grandes quantités d’éthanol à 70% pour stériliser l’abdomen. À partir de cette étape, travaillez à l’intérieur de la hotte sur le bac à glace 1. Ouvrez les sacs embryonnaires et transférez les embryons dans la boîte de 10 cm avec HBSS, en vous assurant que les embryons sont complètement immergés. Retirez la tête de l’embryon avec des ciseaux et placez-la dans le plat de 6 cm avec HBSS. Répétez ce processus avec tous les embryons.REMARQUE: Pour éviter la contamination, tous les tissus, à l’exception des têtes d’embryons, doivent être jetés dans un récipient muni d’un bouchon à vis. Tenez la tête de l’embryon avec une pince finement incurvée et percez les orbites avec une paire de pinces droites fines, en entrant à un angle de 45°, puis relâchez les pinces finement incurvées.REMARQUE: Les forceps ne doivent pas traverser le cerveau, il est donc important de maintenir l’angle lors de l’entrée. Disséquez la peau et le crâne avec les ciseaux chirurgicaux, en commençant par l’os occipital jusqu’à l’os frontal. Retirez le cerveau avec une paire de pinces finement incurvées et placez-le dans le plat de 6 cm avec Hibernate + B27. Répétez ce processus jusqu’à ce que tous les cerveaux soient récupérés. Séparez sagittiquement les télencéphales avec la pince droite fine.NOTE: A partir de cette étape, la dissection de l’hippocampe est réalisée sous un stéréomicroscope. Il est recommandé d’utiliser des lampes articulées pour que la lumière éclaire la surface de dissection par les côtés. Il est également recommandé d’utiliser un fond noir car cela offre plus de contraste, permettant de mieux distinguer l’hippocampe. Préparez un plat de 10 cm en plaçant des gouttes d’Hibernate + B27 à des distances de 1 cm (p. ex., en cercle). Placez un télencéphale par goutte d’Hibernate + B27 et visualisez à travers la lunette de dissection (un grossissement objectif de 1,25x est recommandé). Pelez soigneusement les méninges et retirez le thalamus pour mieux visualiser l’hippocampe. Disséquez l’hippocampe avec les ciseaux à ressort de précision et placez-le dans le plat de 3,5 cm avec Hibernate + B27 dans le bac à glace 2. Répéter pour chaque télencéphale jusqu’à ce que tous les hippocampes soient collectés. Prélever soigneusement tous les hippocampes à l’aide d’une pipette Pasteur et les transférer dans un tube de 50 mL.NOTE: Prenez le volume minimum d’Hibernate + B27 lors de la collecte de l’hippocampe afin de ne pas diluer la trypsine. Dissociation cellulaireDissociation enzymatique de l’hippocampeDans le tube de 50 mL contenant l’hippocampe, ajouter 1 mL de trypsine à 2,5 % et porter à un volume de 5 mL avec HBSS. Incuber pendant 15 min au bain-marie à 37 °C. Pour diluer la trypsine, ajouter 10 mL de HBSS préchauffé et incuber pendant 5 min au bain-marie à 37 °C. Transférer l’hippocampe qui apparaît maintenant sous forme de masse de mucus dans un tube de 50 mL avec une micropipette de 1 000 μL, ajouter 6 mL de HBSS préchauffé et incuber pendant 5 min au bain-marie à 37 °C. Dissociation mécanique de l’hippocampeTransférer la masse dans un tube de 2 mL à fond conique, en prenant le volume minimal. Ajouter 1 mL de média DMEM préchauffé. Homogénéiser la pastille avec une micropipette de 1 000 μL en aspirant doucement de haut en bas.REMARQUE: Il est essentiel d’éviter de générer des bulles lors de l’aspiration car les bulles peuvent lyser les cellules. Répétez l’aspiration de haut en bas avec une pipette en verre pré-tirée (10x-20x), avec son embout en contact avec le fond conique du tube. Évitez de générer des bulles. A la fin de cette étape, le mélange doit être translucide. Une fois mélangé de manière homogène de manière à ce que le mélange soit translucide, transférer le mélange dans un tube contenant 4 ml de milieu DMEM à 37 °C et homogénéiser avec une pipette en verre en pipetant de haut en bas. Ensemencement cellulaireComptez les cellules. Le nombre de neurones dans la solution peut être compté selon les procédures de laboratoire standard.REMARQUE: Dans les expériences d’imagerie pour la détection des anticorps et l’activité calcique, une concentration de 50 000 cellules par boîte de 3,5 cm est optimale. En maintenant les cellules suspendues, prélever le volume calculé et plaquer dans des boîtes de 3,5 cm contenant des lamelles de couverture enduites de PLL ou dans des boîtes à fond de verre enduites de PLL. Répartir uniformément les cellules sur les plats en agitant doucement en mouvements croisés (d’avant en arrière, puis d’un côté à l’autre; répéter au besoin) et placer les plats dans l’incubateur de CO2 (5%).NOTE: Il est important d’utiliser des mouvements croisés pour éviter que les cellules ne se déposent à la périphérie de la boîte. Chaque semaine, ajouter environ 1 mL de NB + B27, afin que la culture ne sèche pas.NOTE: Après 2 semaines (14 jours in vitro [div]), les neurones sont matures et expriment tous les facteurs à utiliser pour l’expérimentation. Le nombre moyen total de neurones obtenus à l’aide de ce protocole est d’environ 2,5 x 106 neurones provenant d’une moyenne de 12 embryons E18 par rat gravide.    PARTIE 2: Utilisation de cultures neuronales hippocampiques pour la détection d’anticorps dans les protéines de surface des cellules neuronales NOTE: Cette partie du protocole démontre comment les cultures hippocampiques sont utilisées pour identifier les anticorps anti-NMDAR dans le sérum et / ou le LCR des patients atteints d’encéphalite anti-NMDAR. L’immunomarquage fluorescent est utilisé pour visualiser la réactivité dans les neurones vivants, mais d’autres méthodes de visualisation pourraient également être utilisées. Un témoin approprié pour cette expérience serait le sérum ou le LCR d’un individu en bonne santé. Lorsque vous utilisez des échantillons humains, gardez à l’esprit que l’approbation du comité d’éthique de l’établissement peut être requise. 3. Immunomarquage fluorescent vivant Utilisez 14 cellules div qui ont été cultivées sur des lamelles de couverture (50 000 cellules par boîte de 3,5 cm contenant cinq lamelles de couverture). À l’intérieur de la hotte, rincer les lamelles de couverture avec NB préchauffé à 37 °C. Ajouter l’échantillon qui, dans ce cas, contient des anticorps anti-NMDAR (utilisés comme anticorps primaires) dilués dans un milieu NB à 1:200 pour le sérum ou 1:2 pour le LCR et incuber 1 h à 37 °C (à l’intérieur de l’incubateur de CO2 (5%). Rincer soigneusement avec PBS 3x à TA. Ajouter la solution de fixation (4% de formaldéhyde dans PBS) et incuber à TA pendant 5 min.ATTENTION : Lorsque vous manipulez du formaldéhyde à 4 %, travaillez à l’intérieur de la hotte et portez l’équipement de protection individuelle recommandé. Laver 3x avec PBS pendant 5 min chacun. Ajouter l’anticorps secondaire Chèvre anti-humain AF488 à 1:1000 dilution et incuber à TA pendant 1 h.REMARQUE: Pendant l’incubation, protéger de l’exposition à la lumière en recouvrant de papier d’aluminium. Laver 3x avec PBS pendant 5 min chacun. Rincer à l’eau distillée Montez les lamelles de recouvrement avec un support de montage liquide (p. ex., support de montage anti-décoloration avec DAPI; environ 7 μL), aspirez tout liquide restant et rincez à l’eau distillée. Les neurones sont maintenant prêts pour l’imagerie par fluorescence.ATTENTION : Lorsque vous manipulez un support de montage, portez l’équipement de protection individuelle recommandé.     PARTIE 3 : Démonstration des effets pathogènes des anticorps par imagerie calcique NOTE: Cette partie du protocole montre comment déterminer si les anticorps chez les patients ont un effet fonctionnel sur les cultures, ce qui suggérerait une pathogénicité. Afin d’augmenter l’importance des effets, un pool de LCR provenant de huit patients a été utilisé. L’activité calcique des cultures vivantes a été enregistrée lors de la stimulation chimique (NMDA + glycine) à l’aide de l’indicateur de calcium de fluorescence GECI (GCaMP5G). Ces études nécessitent un microscope à fluorescence inversée avec une chambre cellulaire capable de maintenir les conditions physiologiques requises des neurones. 4. Imagerie calcique Utiliser 14 à 18 cellules div qui ont été cultivées sur des lamelles de couverture (50 000 cellules par boîte de 3,5 cm avec cinq lamelles de couverture) 1 semaine avant l’imagerie, ajouter le vecteur viral pAAV2-CAG-GCaMP5G à 2,5 x 1010 GC/mL aux cellules et incuber pendant 5 à 7 jours.REMARQUE : Ce vecteur AAV préemballé du sérotype 2, disponible dans le commerce, surexprime l’indicateur de calcium génétiquement codé GCaMP5G sous un promoteur CAG. 1 jour avant l’imagerie, ajouter l’échantillon du patient (dans cet exemple, un pool de LCR dilué 1:25 dans NB + B27) et incuber pendant 24 h. Toujours filtrer les échantillons humains (taille des pores de 0,2 μm) avant utilisation pour éviter toute contamination.REMARQUE : Pour ces études, le LCR témoin de sujets sains doit être effectué en parallèle. Le jour de l’imagerie, préparez l’installation d’imagerie et réglez la chambre de la cellule du microscope à 37 °C, remplissez la voie avec de l’eau distillée et infusez avec 5% de CO2 pour maintenir les conditions physiologiques cellulaires. Dans la hotte, laver les cellules de l’étape 3 avec 3 mL de PSE préchauffé à 37 °C Couvrir les cellules avec 2,45 mL d’EPS et les transférer dans la chambre cellulaire du microscope. Ajouter NBQX (10 μM) pour bloquer les récepteurs AMPA et KA afin de visualiser exclusivement la réponse du récepteur NMDA. Dans le microscope à fluorescence inversée équipé d’une lampe au mercure et d’un cube filtrant FITC, acquérir un film de 2 min avec des images enregistrées toutes les 100 ms (activité spontanée).REMARQUE: Un objectif d’air NA 0.75 20x a été utilisé et des images (512 x 512 pixels, niveaux de gris 16 bits) ont été prises toutes les 100 ms avec une caméra sCMOS. Acquérir le deuxième film de 4 min avec des images enregistrées toutes les 100 ms. Peu de temps après le début de l’acquisition, ajouter une solution de stimulation (NMDA [100 μM] + glycine [1 μM]) au plat.REMARQUE: L’ajout de média dans l’antenne générera des turbulences qui pourraient perturber les conditions d’imagerie (mise au point, intensité de fluorescence et / ou signal de fond non spécifique). N’ajoutez pas plus de 50 μL de solution dans la capsule remplie de 2,5 mL pour diminuer la probabilité de telles altérations. À l’aide d’un logiciel de traitement d’images (ImageJ a été utilisé ici), extraire le signal de fluorescence au fil du temps, obtenu lors de la stimulation, à partir des cultures incubées avec le patient et contrôler des échantillons de LCR.REMARQUE: Les sondes GCaMP, lorsqu’elles se lient aux ions calcium libres, subissent un changement conformationnel qui les rend plus brillantes. Par conséquent, l’augmentation de l’intensité de fluorescence est en corrélation avec un afflux de calcium dû à la dépolarisation neuronale. Déterminez les régions d’intérêt (ROI) à analyser. Segmentez manuellement les somas des neurones et ajoutez les ROI au gestionnaire de ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Enregistrez le retour sur investissement à partir du menu ROI Manager (Plus > Enregistrer). Définissez les mesures (Analyser > Définir les mesures) et sélectionnez la valeur de gris moyenne. Extrayez le profil d’intensité de fluorescence moyenne des somas cellulaires en cliquant sur Plus > Multimesure, puis enregistrez le tableau généré sous forme de feuille de calcul .xls. Effectuer des analyses statistiques pour comparer la fluorescence entre les groupes (LCR des patients vs LCR du contrôle).