Summary

Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau

Published: April 28, 2022
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Summary

Cette méthode de purification biochimique avec analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse facilite la caractérisation robuste des noyaux de fibrilles amyloïdes, ce qui peut accélérer l’identification de cibles pour la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Abstract

Les inclusions fibrillaires protéiques sont des caractéristiques pathologiques clés de multiples maladies neurodégénératives. Dans les premiers stades de la maladie d’Alzheimer (MA), les peptides bêta-amyloïdes forment des protofibrilles dans l’espace extracellulaire, qui agissent comme des graines qui se développent progressivement et mûrissent en grandes plaques amyloïdes. Malgré cette compréhension de base, les connaissances actuelles sur la structure, la composition et les modèles de dépôt des fibrilles amyloïdes dans le cerveau sont limitées. Une barrière majeure a été l’incapacité d’isoler les fibrilles amyloïdes hautement purifiées des extraits de cerveau. Des approches basées sur la purification par affinité et la capture laser par microdissection ont déjà été utilisées pour isoler les amyloïdes, mais sont limitées par la petite quantité de matériau qui peut être récupérée. Ce nouveau protocole robuste décrit la purification biochimique des noyaux de plaque amyloïde à l’aide de la solubilisation au dodécylsulfate de sodium (SDS) avec ultracentrifugation et ultrasons du gradient de densité de saccharose et donne des fibrilles très pures de patients atteints de MA et de tissus cérébraux modèles de DA. L’analyse protéomique ascendante basée sur la spectrométrie de masse (SEP) du matériau purifié représente une stratégie robuste pour identifier presque tous les composants protéiques primaires des fibrilles amyloïdes. Des études protéomiques antérieures sur les protéines de la couronne amyloïde ont révélé une collection de protéines étonnamment grande et fonctionnellement diversifiée. Notamment, après avoir affiné la stratégie de purification, le nombre de protéines co-purifiantes a été réduit de plus de 10 fois, ce qui indique la grande pureté du matériau insoluble isolé SDS. La coloration négative et la microscopie électronique immuno-or ont permis de confirmer la pureté de ces préparations. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les attributs spatiaux et biologiques qui contribuent au dépôt de ces protéines dans les inclusions amyloïdes. Dans l’ensemble, cette stratégie analytique est bien positionnée pour améliorer la compréhension de la biologie amyloïde.

Introduction

L’amyloïde est un arrangement supramoléculaire extrêmement stable que l’on trouve dans un panel diversifié de protéines, dont certaines conduisent à des changements pathologiques1. L’accumulation d’agrégats amyloïdes intra- ou extracellulaires est observée dans plusieurs maladies neurodégénératives2. Les agrégats amyloïdes sont hétérogènes et sont enrichis d’un grand nombre de protéines et de lipides3. Au cours des dernières années, l’intérêt pour le protéome amyloïde a suscité un intérêt considérable parmi les neuroscientifiques de base et translationnels. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour extraire et purifier les agrégats amyloïdes des tissus cérébraux humains de souris et post-mortem. La microdissection par capture laser, l’immunoprécipitation, la décellularisation et l’isolement biochimique des agrégats amyloïdes sont des méthodes largement utilisées pour extraire et purifier les plaques amyloïdes, les fibrilles et les oligomères 4,5,6,7. Beaucoup de ces études se sont concentrées sur la détermination de la composition protéique de ces dépôts fibrillaires étroitement emballés à l’aide de la SEP semi-quantitative. Cependant, les résultats disponibles sont incohérents et le nombre étonnamment élevé de protéines co-purifiantes précédemment rapportées est difficile à interpréter.

La principale limite de la littérature existante décrivant le protéome du noyau amyloïde dans les cerveaux modèles murins AD et AD est que le matériel purifié contient un nombre ingérable de protéines co-purifiantes. L’objectif global de cette méthode est de surmonter cette limitation et de développer une purification biochimique robuste pour isoler les noyaux de fibrilles amyloïdes. Cette stratégie utilise une méthode biochimique basée sur l’ultracentrifugation du gradient de densité de saccharose décrite précédemment pour isoler les fractions amyloïdes enrichies insolubles dans le SDS à partir de tissus cérébraux humains et murins post-mortemAD 8,9. Cette méthode s’appuie sur la littérature existante, mais va plus loin avec les ultrasons et les lavages SDS pour éliminer la plupart des protéines associées à l’amyloïde faiblement liées, conduisant à l’isolement des fibrilles amyloïdes hautement purifiées (Figure 1). Les fibrilles purifiées par ce protocole surmontent plusieurs défis existants fréquemment rencontrés dans les études structurelles de fibrilles amyloïdes isolées à partir d’extraits cérébraux. La visualisation de ces fibrilles par microscopie électronique à transmission (TEM) confirme l’intégrité et la pureté du matériau purifié (Figure 2). Dans cette étude, les fibrilles isolées sont solubilisées et digérées en peptides avec de la trypsine, et l’analyse de la SEP sans étiquette peut facilement révéler l’identité des protéines formant le noyau de la fibrilure. Notamment, certaines de ces protéines ont une tendance inhérente à former des assemblages supramoléculaires dans des organites non liés à la membrane. En outre, de nombreuses protéines identifiées dans l’analyse des fibrilles bêta-amyloïdes (Aβ) sont également associées à d’autres maladies neurodégénératives, ce qui suggère que ces protéines peuvent jouer un rôle clé dans de multiples protéinopathies.

Il est peu probable que cette méthode de FDS/ultrasons modifie ou perturbe la structure des noyaux de fibrilles. Le matériau purifié convient également à un large éventail d’approches d’analyse protéomique descendante et ascendante et à d’autres stratégies d’analyse structurelle basées sur la SEP, telles que la réticulation chimique ou l’échange hydrogène-deutérium. La récupération globale à l’aide de cette méthode est relativement élevée et convient donc aux études structurelles détaillées, qui nécessitent des microgrammes à des milligrammes du matériau purifié. Le matériau purifié convient également aux études structurelles utilisant cryoEM et la microscopie à force atomique. Ce protocole, combiné au marquage isotopique stable des mammifères, peut faciliter les études par résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide de la structure amyloïde10.

Protocol

Ce protocole implique l’utilisation de tissus cérébraux humains ou vertébrés. Toutes les recherches ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles approuvées par l’Université Northwestern. Le flux de travail actuel est normalisé à l’aide d’extraits corticaux du cerveau de souris et de la région cérébrale de l’hippocampe APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F)11. Ce protocole a été optimisé pour les extraits de cerveau de souris âgées de …

Representative Results

Ici, une méthode détaillée pour l’isolement et la purification des fibrilles amyloïdes à l’aide d’une méthode modifiée de purification par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose est résumée (voir la figure 1). L’innovation dans cette méthode est l’inclusion d’étapes de lavage par ultrasons à l’aide d’un système de sonication au bain-marie suivi d’une solubilisation SDS, qui élimine de nombreuses protéines faiblement associées des fibrille…

Discussion

Développer une compréhension claire de la structure et de la composition amyloïdes est difficile pour les biologistes structuraux et les biochimistes en raison des complexités biologiques et des limites expérimentales dans l’extraction des fibrilles purifiées des tissus cérébraux de laMA 16,17. Les fibrilles amyloïdes sont polymorphes au niveau moléculaire, montrant une population hétérogène de longueurs et de complexités variables<sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la subvention niH R01AG061865 à R.J.V. et J.N.S. Les auteurs remercient les membres du groupe de recherche Vassar et Savas de l’Université Northwestern pour leurs discussions réfléchies. Nous remercions également sincèrement dr(s). Ansgar Seimer et Ralf Langen de l’Université de Californie du Sud pour leur contribution cruciale. Nous remercions le Dr Farida Korabova pour la préparation des échantillons et l’imagerie par microscopie électronique à coloration négative au Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

Materials

Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm Thermo Scientific 164535 Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody Biolegend 803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody Biolegend 800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody IBL America 10323
anti-amyloid fibril LOC antibody  EMD Millipore AB2287
BCA kit Thermo Fisher Scientific 23225
Bioruptor Pico Plus Diagenode B01020001
Calcium Chloride Sigma-Aldrich  C1016
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
Complete  Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 11697498001
Dnase I Thermo Fisher Scientific EN0521
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
HyperSep C18 Cartridges Thermo Fisher Scientific 60108-302
Integrated Proteomics Pipeline – IP2  http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich I1149
K54 Tissue Homogenizing System Motor Cole Parmer Glas-Col 099C
MaxQuant https://www.maxquant.org/
Micro BCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
Nanoviper 75 μm x 50 cm Thermo Scientific 164942
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter BR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin Columns Thermo Fisher Scientific 89870
Precellys 24 tissue homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer Promega V2072
RawConverter http://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azide VWR 97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 74255
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002446
Speed Vaccum Concentrator Labconco 7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-2G
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific 15568025
Trypsin Gold-Mass spec grade Promega V5280
UltiMate 3000 RSLCnano System Thermo Scientific ULTIM3000RSLCNANO

References

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Cite This Article
Upadhyay, A., Vassar, R. J., Savas, J. N. Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain. J. Vis. Exp. (182), e63816, doi:10.3791/63816 (2022).

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