טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

עמילואיד הוא סידור סופראמולקולרי יציב ביותר שנמצא בפאנל מגוון של חלבונים, שחלקם מובילים לשינויים פתולוגיים¹. הצטברות של אגרגטים עמילואידיים תוך או חוץ-תאיים נצפית במספר מחלות נוירודגנרטיביות². אגרגטי עמילואיד הם הטרוגניים ומועשרים במספר רב של חלבונים ושומנים³. בשנים האחרונות, העניין בפרוטאום העמילואידי עורר עניין רב בקרב מדעני מוח בסיסיים ותרגומים. מספר שיטות פותחו כדי לחלץ ולטהר אגרגטים עמילואידיים מרקמות מוח אנושיות של עכברים ופוסט-מורטם. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר, מיצוי חיסוני, דה-תאיזציה ובידוד ביוכימי של אגרגטים עמילואידיים הן שיטות נפוצות לחילוץ וטיהור של פלאקים עמילואידים, פיברילים ואוליגומרים 4,5,6,7. רבים מהמחקרים האלה התמקדו בקביעת הרכב החלבון של מרבצי הפיברילארים הדחוסים האלה באמצעות טרשת נפוצה כמותית למחצה. עם זאת, התוצאות הזמינות אינן עקביות, והמספר הגדול באופן מפתיע של חלבונים המטהרים יחד שדווחו בעבר מאתגר לפענוח.

המגבלה העיקרית של הספרות הקיימת המתארת את הפרוטאום של ליבת העמילואיד במוחות של עכברי AD ו-AD היא שהחומר המטוהר מכיל מספר בלתי ניתן לניהול של חלבונים המטהרים יחד. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להתגבר על מגבלה זו ולפתח טיהור ביוכימי חזק לבידוד ליבות פיבריל עמילואידיות. אסטרטגיה זו משתמשת בשיטה ביוכימית מבוססת אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות סוכרוז שתוארה קודם לכן לבידוד של שברים עמילואידים מועשרים בלתי מסיסים של SDS מרקמות מוח של אדם ועכבר AD שלאחר המוות ^8,9. שיטה זו מתבססת על הספרות הקיימת, אך מרחיקת לכת יותר עם אולטרה-סוניזציה ושטיפות SDS כדי להסיר את רוב החלבונים הקשורים לעמילואיד הקשורים באופן רופף, מה שמוביל לבידוד של סיבי עמילואיד מטוהרים מאוד (איור 1). הפיברילים המטוהרים על ידי פרוטוקול זה מתגברים על מספר אתגרים קיימים שנתקלים בהם לעתים קרובות במחקרים מבניים של סיבי עמילואיד המבודדים מתמציות מוח. הדמיה של הפיברילים האלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) מאשרת את השלמות והטוהר של החומר המטוהר (איור 2). במחקר זה, הפיברילים המבודדים עוברים בדידות ומעוכלים לפפטידים עם טריפסין, וניתוח טרשת נפוצה ללא תווית יכול לחשוף בקלות את זהות החלבונים היוצרים את ליבת הפיבריל. יש לציין כי לחלק מחלבונים אלה יש נטייה מובנית ליצור מכלולים סופראמולקולריים באברונים שאינם קשורים לממברנה. בנוסף, רבים מהחלבונים שזוהו בניתוח של פיברילי עמילואיד-בטא (Aβ) קשורים גם למחלות נוירודגנרטיביות אחרות, מה שמרמז על כך שחלבונים אלה עשויים למלא תפקיד מפתח בפרוטאינופתיות מרובות.

סביר להניח ששיטת SDS/אולטרה-סוניקציה זו לא תשנה או תשבש את מבנה ליבות הפיבריל. החומר המטוהר מתאים גם למגוון רחב של גישות אנליזה פרוטאומיות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה ולאסטרטגיות ניתוח מבניות נוספות המבוססות על טרשת נפוצה, כגון הצלבה כימית או חילופי מימן-דאוטריום. ההתאוששות הכוללת בשיטה זו גבוהה יחסית, ולכן מתאימה למחקרים מבניים מפורטים, הדורשים מיקרוגרם למיליגרם של החומר המטוהר. החומר המטוהר מתאים גם למחקרים מבניים באמצעות cryoEM ומיקרוסקופיית כוח אטומי. פרוטוקול זה, בשילוב עם התווית האיזוטופית היציבה של יונקים, יכול להקל על מחקרי תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק (NMR) של מבנה עמילואיד¹⁰.