Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Amyloid ist eine extrem stabile supramolekulare Anordnung, die in einer Vielzahl von Proteinen vorkommt, von denen einige zu pathologischen Veränderungen führen¹. Die Akkumulation von intra- oder extrazellulären Amyloidaggregaten wird bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen^{beobachtet 2}. Amyloid-Aggregate sind heterogen und mit einer Vielzahl von Proteinen und Lipiden angereichert³. In den letzten Jahren hat das Interesse am Amyloid-Proteom bei grundlegenden und translationalen Neurowissenschaftlern ein erhebliches Interesse geweckt. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Amyloidaggregate aus Maus- und postmortalem menschlichem Hirngewebe zu extrahieren und zu reinigen. Laser-Capture-Mikrodissektion, Immunpräzipitation, Dezellularisierung und biochemische Isolierung von Amyloid-Aggregaten sind weit verbreitete Methoden zur Extraktion und Reinigung von Amyloid-Plaques, Fibrillen und Oligomeren 4,5,6,7. Viele dieser Studien haben sich darauf konzentriert, die Proteinzusammensetzung dieser dicht gepackten fibrillären Ablagerungen unter Verwendung von semiquantitativer MS zu bestimmen. Die verfügbaren Ergebnisse sind jedoch inkonsistent, und die überraschend große Anzahl von Co-Cleanifying-Proteinen, die zuvor berichtet wurden, sind schwierig zu interpretieren.

Die primäre Einschränkung der bestehenden Literatur, die das Amyloidkernproteom in AD- und AD-Mausmodellgehirnen beschreibt, besteht darin, dass das gereinigte Material eine unüberschaubare Anzahl von mitreinigenden Proteinen enthält. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, diese Einschränkung zu überwinden und eine robuste biochemische Reinigung zur Isolierung von Amyloidfibrillenkernen zu entwickeln. Diese Strategie verwendet eine zuvor beschriebene auf Succharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende biochemische Methode zur Isolierung von SDS-unlöslichen angereicherten Amyloidfraktionen aus postmortalem AD-Hirngewebe^von Menschen und Mäusen ^8,9. Diese Methode baut auf der vorhandenen Literatur auf, geht aber mit Ultraschall und SDS-Waschungen weiter, um die meisten der lose gebundenen Amyloid-assoziierten Proteine zu entfernen, was zur Isolierung von hochgereinigten Amyloidfibrillen führt (Abbildung 1). Die durch dieses Protokoll gereinigten Fibrillen überwinden mehrere bestehende Herausforderungen, die häufig in Strukturstudien von Amyloidfibrillen auftreten, die aus Gehirnextrakten isoliert wurden. Die Visualisierung dieser Fibrillen mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt die Integrität und Reinheit des gereinigten Materials (Abbildung 2). In dieser Studie werden die isolierten Fibrillen mit Trypsin gelöst und zu Peptiden verdaut, und eine markierungsfreie MS-Analyse kann die Identität der Proteine, die den Fibrillenkern bilden, leicht aufdecken. Insbesondere haben einige dieser Proteine eine inhärente Tendenz, supramolekulare Anordnungen in nicht membrangebundenen Organellen zu bilden. Darüber hinaus sind viele der Proteine, die bei der Analyse von Amyloid-Beta (Aβ)-Fibrillen identifiziert wurden, auch mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert, was darauf hindeutet, dass diese Proteine eine Schlüsselrolle bei multiplen Proteinopathien spielen können.

Es ist unwahrscheinlich, dass diese SDS / Ultraschallmethode die Struktur der Fibrillenkerne verändert oder stört. Das gereinigte Material eignet sich auch für eine Vielzahl von Top-down- und Bottom-up-Proteomanalyseansätzen und zusätzlichen MS-basierten Strukturanalysestrategien, wie chemische Vernetzung oder Wasserstoff-Deuterium-Austausch. Die Gesamtausbeute mit dieser Methode ist relativ hoch und eignet sich daher für detaillierte Strukturuntersuchungen, die Mikrogramm bis Milligramm des gereinigten Materials erfordern. Das gereinigte Material eignet sich auch für Strukturuntersuchungen mittels KryoEM und Rasterkraftmikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit der stabilen Isotopenmarkierung von Säugetieren Festkörper-Kernspinresonanzuntersuchungen (NMR) der^{Amyloidstruktur 10} erleichtern.