Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

Amiloide é um arranjo supramolecular extremamente estável que é encontrado em um painel diversificado de proteínas, algumas das quais levam a mudanças patológicas¹. O acúmulo de agregados amiloides intra ou extracelulares é observado em várias doenças neurodegenerativas². Os agregados amiloides são heterogêneos e são enriquecidos com um grande número de proteínas e lipídios³. Nos últimos anos, o interesse pelo proteome amiloide tem gerado interesse substancial entre neurocientistas básicos e translacionais. Vários métodos foram desenvolvidos para extrair e purificar agregados amiloides de tecidos cerebrais humanos de camundongos e pós-morte. Microdisseção de captura a laser, imunoprecipitação, descelularização e isolamento bioquímico de agregados amiloides são métodos amplamente utilizados para extrair e purificar placas amiloides, fibrilas e oligômeros 4,5,6,7. Muitos desses estudos têm se concentrado em determinar a composição proteica desses depósitos fibrilares bem embalados usando em ms semi-quantitativo. No entanto, os resultados disponíveis são inconsistentes, e o número surpreendentemente grande de proteínas co-purificadoras relatadas anteriormente são desafiadores de interpretar.

A principal limitação da literatura existente descrevendo o núcleo amiloide nos cérebros modelo de camundongos AD e AD é que o material purificado contém um número incontrolável de proteínas co-purificadoras. O objetivo global deste método é superar essa limitação e desenvolver uma purificação bioquímica robusta para isolar núcleos de fibrila amiloide. Esta estratégia emprega um método bioquímico baseado em afluente de densidade de sacarose anteriormente descrito para o isolamento de frações amiloides enriquecidas insolúveis da SDS a partir de tecidos cerebrais humanos e camundongos pós-morte ^8,9. Este método baseia-se na literatura existente, mas vai além com a ultrassonização e as lavagens SDS para remover a maioria das proteínas amiloides frouxamente ligadas, levando ao isolamento de fibrilas amiloides altamente purificadas (Figura 1). As fibrilas purificadas por este protocolo superam vários desafios existentes frequentemente encontrados em estudos estruturais de fibrilas amiloides isolados de extratos cerebrais. A visualização dessas fibrilas com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirma a integridade e pureza do material purificado (Figura 2). Neste estudo, as fibrilas isoladas são solubilizadas e digeridas em peptídeos com trippsina, e a análise de MS sem rótulos pode facilmente revelar a identidade das proteínas que formam o núcleo fibril. Notavelmente, algumas dessas proteínas têm uma tendência inerente à formação de conjuntos supramoleculares em organelas não ligadas à membrana. Além disso, muitas das proteínas identificadas na análise de fibrilas amilóide-beta (Aβ) também estão associadas a outras doenças neurodegenerativas, sugerindo que essas proteínas podem desempenhar um papel fundamental em múltiplas proteinopatias.

Este método SDS/ultrasonicação é improvável de alterar ou interromper a estrutura dos núcleos fibril. O material purificado também é adequado para uma ampla gama de abordagens de análise proteômica de cima para baixo e de baixo para cima e estratégias adicionais de análise estrutural baseada em MS, como crosslinking químico ou troca de deutério de hidrogênio. A recuperação geral usando este método é relativamente alta e, portanto, é adequada para estudos estruturais detalhados, que requerem microgramas a miligramas do material purificado. O material purificado também é adequado para estudos estruturais utilizando crioEM e microscopia de força atômica. Este protocolo, em combinação com a rotulagem isotópica estável de mamíferos, pode facilitar estudos de ressonância magnética nuclear de estado sólido (RMN) da estrutura amiloide¹⁰.