脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

アミロイドは、タンパク質の多様なパネルに見られる非常に安定した超分子配列であり、そのうちのいくつかは病理学的変化をもたらす¹。細胞内または細胞外のアミロイド凝集体の蓄積は、いくつかの神経変性疾患において観察^される2。アミロイド凝集体は不均一であり、多数のタンパク質および脂質で富化されている³。近年、アミロイドプロテオームへの関心は、基礎および翻訳神経科学者の間で大きな関心を生み出している。マウスおよび死後のヒト脳組織からアミロイド凝集体を抽出および精製するために、いくつかの方法が開発されている。レーザー捕捉マイクロダイセクション、免疫沈降、脱細胞化、およびアミロイド凝集体の生化学的単離は、アミロイドプラーク、線維、およびオリゴマー^を抽出および精製するために広く使用されている方法である^4,5,6,7。これらの研究の多くは、半定量的MSを使用して、これらの密に充填された線維性沈着物のタンパク質組成を決定することに焦点を当てている。しかし、利用可能な結果は一貫性がなく、以前に報告された驚くほど多数の共精製タンパク質は解釈が困難です。

ADおよびADマウスモデル脳におけるアミロイドコアプロテオームを記述する既存の文献の主な制限は、精製された材料が管理不能な数の共精製タンパク質を含むことである。この方法の全体的な目標は、この制限を克服し、アミロイド線維コアを単離するための堅牢な生化学的精製を開発することです。この戦略は、死後ADヒトおよびマウス脳組織からのSDS不溶性富化アミロイド画分の単離のために、先に記載したスクロース密度勾配超遠心ベースの生化学的方法を採用する^8、9。この方法は既存の文献に基づいていますが、超音波処理とSDS洗浄をさらに進めて、緩く結合したアミロイド関連タンパク質の大部分を除去し、高度に精製されたアミロイド線維の単離につながります(図1)。このプロトコールによって精製された線維は、脳抽出物から単離されたアミロイド線維の構造研究において頻繁に遭遇するいくつかの既存の課題を克服する。透過型電子顕微鏡(TEM)によるこれらのフィブリルの可視化は、精製された材料の完全性および純度を確認する(図2)。この研究では、単離されたフィブリルを可溶化し、トリプシンでペプチドに消化し、ラベルフリーMS分析により、フィブリルコアを形成するタンパク質の同一性を容易に明らかにすることができる。特に、これらのタンパク質のいくつかは、非膜結合細胞小器官において超分子集合体を形成する固有の傾向を有する。さらに、アミロイドβ(Aβ)線維の分析で同定されたタンパク質の多くは、他の神経変性疾患とも関連しており、これらのタンパク質が複数のプロテインオパチーにおいて重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されている。

このSDS /超音波処理方法は、フィブリルコアの構造を変更または破壊する可能性は低いです。精製された材料は、幅広いトップダウンおよびボトムアッププロテオーム分析アプローチや、化学架橋や水素 – 重水素交換などの追加のMSベースの構造解析戦略にも適しています。この方法を用いた全体的な回収率は比較的高く、したがって、精製された材料のマイクログラム〜ミリグラムを必要とする詳細な構造研究に適している。精製された材料は、クライオEMおよび原子間力顕微鏡を用いた構造研究にも適している。このプロトコールは、哺乳動物の安定同位体標識と組み合わせて、アミロイド構造¹⁰の固体核磁気共鳴(NMR)研究を促進することができる。