Summary

Analyse van astrocytengebiedvolume en tegels in dikke vrij zwevende weefselsecties

Published: April 20, 2022
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft methoden voor het doorsnijden, kleuren en afbeelden van vrij zwevende weefselsecties van de muizenhersenen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van de analyse van het astrocytengebiedvolume en astrocytengebied overlap of tegels.

Abstract

Astrocyten bezitten een verbazingwekkende mate van morfologische complexiteit die hen in staat stelt om te interageren met bijna elk type cel en structuur in de hersenen. Door deze interacties reguleren astrocyten actief veel kritieke hersenfuncties, waaronder synapsvorming, neurotransmissie en ionhomeostase. In de hersenen van knaagdieren groeien astrocyten in grootte en complexiteit tijdens de eerste drie postnatale weken en vestigen ze verschillende, niet-overlappende gebieden om de hersenen te betegelen. Dit protocol biedt een gevestigde methode voor het analyseren van astrocytengebiedvolume en astrocytentetettegels met behulp van vrij zwevende weefselsecties uit het muizenbrein. Ten eerste beschrijft dit protocol de stappen voor weefselverzameling, cryosectie en immunostaining van vrij zwevende weefselsecties. Ten tweede beschrijft dit protocol beeldacquisitie en analyse van astrocytengebiedvolume en territoriumoverlappingsvolume, met behulp van commercieel beschikbare beeldanalysesoftware. Ten slotte bespreekt dit manuscript de voordelen, belangrijke overwegingen, veelvoorkomende valkuilen en beperkingen van deze methoden. Dit protocol vereist hersenweefsel met schaarse of mozaïek fluorescerende labeling van astrocyten en is ontworpen om te worden gebruikt met gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur, confocale microscopie en in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware.

Introduction

Astrocyten zijn uitgebreid vertakte cellen die veel belangrijke functies in de hersenen vervullen1. In de cortex van de muis geven radiale gliastamcellen aanleiding tot astrocyten tijdens de late embryonale en vroege postnatale stadia2. Tijdens de eerste drie postnatale weken groeien astrocyten in omvang en complexiteit en ontwikkelen ze duizenden fijne takken die rechtstreeks interageren met synapsen1. Tegelijkertijd interageren astrocyten met naburige astrocyten om discrete, niet-overlappende gebieden vast te stellen om de hersenen te betegelen3, terwijl de communicatie via gap junction kanalen4 behouden blijft. Astrocytenmorfologie en organisatie zijn verstoord in veel ziektetoestanden na belediging of verwonding5, wat het belang van deze processen voor een goede hersenfunctie aangeeft. Analyse van de morfologische eigenschappen van astrocyten tijdens normale ontwikkeling, veroudering en ziekte kan waardevolle inzichten bieden in de biologie en fysiologie van astrocyten. Bovendien is de analyse van de morfologie van astrocyten na genetische manipulatie een waardevol hulpmiddel voor het onderscheiden van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de oprichting en het onderhoud van de morfologische complexiteit van astrocyten regelen.

Analyse van astrocytenmorfologie in het muizenbrein wordt bemoeilijkt door zowel astrocytenvertakkingscomplexiteit als astrocytentetegels. Antilichaamkleuring met behulp van het intermediaire filament gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) als een astrocytenspecifieke marker vangt alleen de belangrijkste takken en onderschat de morfologische complexiteit van astrocyten enorm1. Andere celspecifieke markers zoals glutamaattransporter 1 (GLT-1; slc1a2), glutaminesynthetase of S100β doen beter werk bij het labelen van astrocytentakken6, maar introduceren een nieuw probleem. Astrocytengebieden zijn grotendeels niet-overlappend, maar er bestaat een kleine mate van overlap aan de perifere randen. Vanwege de complexiteit van vertakkingen, wanneer naburige astrocyten dezelfde kleur krijgen, is het onmogelijk om te onderscheiden waar de ene astrocyt eindigt en de andere begint. Schaarse of mozaïeketikettering van astrocyten met endogene fluorescerende eiwitten lost beide problemen op: de fluorescerende marker vult de cel om alle takken te vangen en maakt beeldvorming van individuele astrocyten mogelijk die kunnen worden onderscheiden van hun buren. Verschillende strategieën zijn gebruikt om schaarse fluorescerende etikettering van astrocyten te bereiken, met of zonder genetische manipulatie, waaronder virale injectie, plasmidelektroporatie of transgene muislijnen. Details over de uitvoering van deze strategieën worden beschreven in eerder gepubliceerde studies en protocollen 1,7,8,9,10,11,12,13.

Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van het astrocytengebiedvolume van muizenhersenen met fluorescerende labeling in een schaarse populatie astrocyten (figuur 1). Omdat de gemiddelde diameter van een astrocyt in de cortex van de muis ongeveer 60 μm is, worden 100 μm dikke secties gebruikt om de efficiëntie bij het vastleggen van individuele astrocyten in hun geheel te verbeteren. Immunostaining is niet vereist, maar wordt aanbevolen om het endogene fluorescerende signaal voor confocale beeldvorming en analyse te verbeteren. Immunostaining kan ook een betere detectie van fijne astrocytentakken mogelijk maken en fotobleaching van endogene eiwitten tijdens beeldacquisitie verminderen. Om de penetratie van antilichamen in de dikke secties te verbeteren en om het weefselvolume te beschermen tegen secties door beeldvorming, worden vrij zwevende weefselsecties gebruikt. Analyse van het astrocytengebiedvolume wordt uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware. Bovendien beschrijft dit protocol een methode voor analyse van astrocytentegels in weefselsecties met mozaïeketikettering, waarbij naburige astrocyten verschillende fluorescerende labels uitdrukken. Dit protocol is met succes gebruikt in verschillende recente studies 1,8,9 om astrocytengroei tijdens normale hersenontwikkeling te karakteriseren, evenals de impact van genetische manipulatie op de ontwikkeling van astrocyten.

Protocol

Alle muizen werden gebruikt in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill en de afdeling Vergelijkende Geneeskunde (IACUC-protocolnummer 21-116.0). Muizen van beide geslachten op postnatale dag 21 (P21) werden gebruikt voor deze experimenten. CD1-muizen werden commercieel verkregen (Tabel van materialen) en MADM9 WT: WT- en MADM9 WT: KO-muizen werden eerder beschreven9. <p class="jove_content…

Representative Results

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen en workflow voor dit protocol. Figuur 2 toont screenshots van belangrijke stappen met behulp van de beeldanalysesoftware om een oppervlak te genereren, vlekken dicht bij het oppervlak te genereren en een bolle romp te genereren. Figuur 3 toont de toepassing van deze techniek om de overlap/tegels van astrocytengebied te bepalen. In figuur 4</st…

Discussion

Dit protocol beschrijft een gevestigde methode voor het analyseren van het astrocytengebiedvolume en astrocytentegels in de cortex van de muis, waarbij alle belangrijke stappen worden beschreven, beginnend met perfusie en eindigend met beeldanalyse. Dit protocol vereist hersenen van muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in een schaarse of mozaïekpopulatie van astrocyten. Buiten deze vereiste kunnen muizen van elke leeftijd voor dit protocol worden gebruikt, met slechts kleine aanpassingen aan de perfu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Microscopie werd uitgevoerd in de UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), gedeeltelijk ondersteund door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. De afbeeldingen en gegevens in figuur 4 zijn met toestemming van de uitgever overgenomen uit een eerdere publicatie9 .

Materials

#5 forceps Roboz RS-5045
1 mL TB Syringe Becton Dickinson (BD) 309623
10x TBS (tris-buffered saline) 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate Genesee Scientific 25-106MP
1x TBS 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate Genesee Scientific 25-107MP
30% Sucrose in TBS 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer 10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice Charles River 022
Collection vial for brains Fisher Scientific 03-337-20
Confocal acquisition software Olympous FV31S-SW
Confocal microscope Olympus FV3000RS
Coverslips Fisher Scientific 12544E
Cryostat Thermo Scientific CryoStar NX50
Cryostat blade Thermo Scientific 3052835
DAPI Invitrogen D1306
Embedding mold Polysciences 18646A-1
Freezing Medium 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody Aves Labs GFP1010
Glycerol Thermo Scientific 158920010
Goat anti-chicken 488 Invitrogen A-11039
Goat anti-rabbit 594 Invitrogen A11037
Goat Serum Gibco 16210064
Heparin Sigma-Aldrich H3149
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Imaris Bitplane N/A Version 9.8.0
MATLAB MathWorks N/A
Metal lunch tin AQUARIUS N/A From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol Sigma-Aldrich 152463
Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5921
Mouting medium 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish VWR 100491-940
N-propyl gallate Sigma-Aldrich 02370-100G
O.C.T. Fisher Scientific 23-730-571
Oil Olympus IMMOIL-F30CC Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6" Roboz RS-6820
Orbital platform shaker Fisher Scientific 88861043 Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush Bogrinuo N/A From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes"
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Pasteur pipet (5.75") VWR 14672-608
Pasteur pipet (9") VWR 14672-380
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541-500G
Razor blade Fisher Scientific 12-640
RFP antibody Rockland 600-401-379
Sectioning medium 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides VWR 48311-703
Sodium chrloide Fisher Scientific BP358-212
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
TBST (TBS + Triton X-100) 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet VWR 414004-002
Tri-bromoethanol Sigma-Aldrich T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Thermo Scientific 424570025
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Triton X-100 (high-quality) Fisher Scientific 50-489-120
XTSpotsConvexHull N/A N/A custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST 0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer 10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium

References

  1. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  2. Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
  3. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  4. Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
  5. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
  6. Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  7. Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
  8. Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
  9. Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
  10. Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
  11. Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
  12. Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
  13. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
  14. O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).

Play Video

Cite This Article
Eaker, A. R., Baldwin, K. T. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (182), e63804, doi:10.3791/63804 (2022).

View Video