Analyse du volume et du carrelage du territoire des astrocytes dans des sections de tissus épais flottants
Summary
Ce protocole décrit des méthodes de sectionnement, de coloration et d’imagerie de sections de tissu flottant librement du cerveau de la souris, suivies d’une description détaillée de l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du chevauchement ou du carrelage du territoire des astrocytes.
Abstract
Les astrocytes possèdent un degré étonnant de complexité morphologique qui leur permet d’interagir avec presque tous les types de cellules et de structures dans le cerveau. Grâce à ces interactions, les astrocytes régulent activement de nombreuses fonctions cérébrales critiques, y compris la formation de synapses, la neurotransmission et l’homéostasie ionique. Dans le cerveau des rongeurs, les astrocytes grossissent et se complexifient au cours des trois premières semaines postnatales et établissent des territoires distincts et qui ne se chevauchent pas pour carreler le cerveau. Ce protocole fournit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes à l’aide de coupes de tissu flottant librement du cerveau de la souris. Tout d’abord, ce protocole décrit les étapes de la collecte de tissus, de la cryosection et de l’immunocoloration des coupes de tissus flottant librement. Deuxièmement, ce protocole décrit l’acquisition d’images et l’analyse du volume du territoire des astrocytes et du volume de chevauchement des territoires, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce. Enfin, ce manuscrit traite des avantages, des considérations importantes, des pièges courants et des limites de ces méthodes. Ce protocole nécessite des tissus cérébraux avec un marquage fluorescent clairsemé ou en mosaïque des astrocytes, et est conçu pour être utilisé avec l’équipement de laboratoire commun, la microscopie confocale et les logiciels d’analyse d’images disponibles dans le commerce.
Introduction
Les astrocytes sont des cellules richement ramifiées qui remplissent de nombreuses fonctions importantes dans le cerveau1. Dans le cortex de la souris, les cellules souches gliales radiales donnent naissance à des astrocytes à la fin de l’embryon et au début du stade postnatal2. Au cours des trois premières semaines postnatales, les astrocytes grossissent en taille et en complexité, développant des milliers de branches fines qui interagissent directement avec les synapses1. Simultanément, les astrocytes interagissent avec les astrocytes voisins pour établir des territoires discrets et non superposés pour carreler le cerveau3, tout en maintenant la communication via les canauxde jonction 4. La morphologie et l’organisation des astrocytes sont perturbées dans de nombreux états pathologiques à la suite d’une insulte ou d’une blessure5, ce qui indique l’importance de ces processus pour le bon fonctionnement du cerveau. L’analyse des propriétés morphologiques des astrocytes au cours du développement normal, du vieillissement et de la maladie peut fournir des informations précieuses sur la biologie et la physiologie des astrocytes. De plus, l’analyse de la morphologie des astrocytes suite à une manipulation génétique est un outil précieux pour discerner les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent l’établissement et le maintien de la complexité morphologique des astrocytes.
L’analyse de la morphologie des astrocytes dans le cerveau de la souris est compliquée à la fois par la complexité de la ramification des astrocytes et par le carrelage des astrocytes. La coloration des anticorps à l’aide de la protéine acide fibrillaire gliale du filament intermédiaire (GFAP) en tant que marqueur spécifique des astrocytes ne capture que les principales branches et sous-estime considérablement la complexité morphologique des astrocytes1. D’autres marqueurs spécifiques aux cellules tels que le transporteur de glutamate 1 (GLT-1; slc1a2), la glutamine synthétase ou S100β marquent mieux les branches6 des astrocytes, mais introduisent un nouveau problème. Les territoires des astrocytes ne se chevauchent en grande partie pas, mais un faible degré de chevauchement existe aux bords périphériques. En raison de la complexité de la ramification, lorsque les astrocytes voisins sont étiquetés de la même couleur, il est impossible de distinguer où un astrocyte se termine et l’autre commence. Le marquage clairsemé ou en mosaïque des astrocytes avec des protéines fluorescentes endogènes résout les deux problèmes: le marqueur fluorescent remplit la cellule pour capturer toutes les branches et permet l’imagerie d’astrocytes individuels qui peuvent être distingués de leurs voisins. Plusieurs stratégies différentes ont été utilisées pour obtenir un marquage fluorescent clairsemé des astrocytes, avec ou sans manipulation génétique, y compris l’injection virale, l’électroporation plasmidique ou les lignées de souris transgéniques. Les détails sur l’exécution de ces stratégies sont décrits dans des études et des protocoles publiés précédemment 1,7,8,9,10,11,12,13.
Cet article décrit une méthode de mesure du volume du territoire des astrocytes à partir de cerveaux de souris avec marquage fluorescent dans une population clairsemée d’astrocytes (Figure 1). Parce que le diamètre moyen d’un astrocyte dans le cortex de la souris est d’environ 60 μm, des sections de 100 μm d’épaisseur sont utilisées pour améliorer l’efficacité de la capture des astrocytes individuels dans leur intégralité. L’immunocoloration n’est pas nécessaire, mais elle est recommandée pour améliorer le signal fluorescent endogène pour l’imagerie et l’analyse confocales. L’immunocoloration peut également permettre une meilleure détection des fines branches astrocytaires et réduire le photoblanchiment des protéines endogènes lors de l’acquisition de l’image. Pour améliorer la pénétration des anticorps dans les sections épaisses et pour préserver le volume tissulaire de la section par imagerie, des sections de tissu flottant librement sont utilisées. L’analyse du volume du territoire des astrocytes est effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce. En outre, ce protocole décrit une méthode d’analyse du carrelage des astrocytes dans des sections de tissus avec marquage en mosaïque, où les astrocytes voisins expriment différentes étiquettes fluorescentes. Ce protocole a été utilisé avec succès dans plusieurs études récentes 1,8,9 pour caractériser la croissance des astrocytes au cours du développement normal du cerveau, ainsi que l’impact de la manipulation génétique sur le développement des astrocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode établie pour analyser le volume du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes dans le cortex de la souris, détaillant toutes les étapes majeures commençant par la perfusion et se terminant par l’analyse d’images. Ce protocole nécessite des cerveaux de souris qui expriment des protéines fluorescentes dans une population clairsemée ou en mosaïque d’astrocytes. En dehors de cette exigence, des souris de tout âge peuvent être utilisées pour ce protocole, avec s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La microscopie a été réalisée au NOYAU DE MICROSCOPIE DES NEUROSCIENCES DE L’UNC (RRID: SCR_019060), soutenue en partie par le financement de la subvention de soutien du NIH-NINDS Neuroscience Center P30 NS045892 et de la subvention de soutien du centre de recherche sur les déficiences intellectuelles et développementales du NIH-NICHD U54 HD079124. La figure 1 a été créée avec BioRender.com. Les images et les données de la figure 4 sont réimprimées à partir d’une publication précédente9 avec l’autorisation de l’éditeur.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
References
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