Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten

Astrozyten sind aufwendig verzweigte Zellen, die viele wichtige Funktionen im Gehirn erfüllen¹. In der Mausrinde entstehen radiale Gliastammzellen Astrozyten während der späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien². Während der ersten drei postnatalen Wochen wachsen Astrozyten an Größe und Komplexität und entwickeln Tausende von feinen Zweigen, die direkt mit Synapsen interagieren¹. Gleichzeitig interagieren Astrozyten mit benachbarten Astrozyten, um diskrete, nicht überlappende Territorien zu schaffen, um das Gehirn zu kacheln³, während die Kommunikation über Gap-Junction-Kanäle^{4 aufrechterhalten wird}. Astrozytenmorphologie und -organisation sind in vielen Krankheitszuständen nach Beleidigung oder Verletzung^{gestört 5}, was auf die Bedeutung dieser Prozesse für die ordnungsgemäße Gehirnfunktion hinweist. Die Analyse der morphologischen Eigenschaften von Astrozyten während normaler Entwicklung, Alterung und Krankheit kann wertvolle Einblicke in die Biologie und Physiologie der Astrozyten liefern. Darüber hinaus ist die Analyse der Astrozytenmorphologie nach genetischer Manipulation ein wertvolles Werkzeug, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu erkennen, die die Etablierung und Aufrechterhaltung der morphologischen Komplexität der Astrozyten steuern.

Die Analyse der Astrozytenmorphologie im Gehirn der Maus wird sowohl durch die Komplexität der Astrozytenverzweigung als auch durch die Astrozytenkachelung erschwert. Die Antikörperfärbung unter Verwendung des intermediären Filament-Glia-Fibrillensäureproteins (GFAP) als astrozytenspezifischer Marker erfasst nur die Hauptzweige und unterschätzt die morphologische Komplexität der Astrozyten^{erheblich 1}. Andere zellspezifische Marker wie Glutamattransporter 1 (GLT-1; slc1a2), Glutaminsynthetase oder S100β ermöglichen eine bessere Markierung von Astrozytenzweigen⁶, führen jedoch zu einem neuen Problem. Astrozyten-Territorien sind weitgehend nicht überlappend, aber ein kleiner Grad an Überlappung existiert an den peripheren Kanten. Aufgrund der Komplexität der Verzweigung, wenn benachbarte Astrozyten mit der gleichen Farbe beschriftet werden, ist es unmöglich zu unterscheiden, wo ein Astrozyt endet und der andere beginnt. Die spärliche oder mosaikartige Markierung von Astrozyten mit endogenen fluoreszierenden Proteinen löst beide Probleme: Der fluoreszierende Marker füllt die Zelle, um alle Zweige zu erfassen, und ermöglicht die Abbildung einzelner Astrozyten, die von ihren Nachbarn unterschieden werden können. Verschiedene Strategien wurden verwendet, um eine spärliche fluoreszierende Markierung von Astrozyten mit oder ohne genetische Manipulation zu erreichen, einschließlich viraler Injektion, Plasmidelektroporation oder transgener Mauslinien. Details zur Umsetzung dieser Strategien sind in bereits veröffentlichten Studien und Protokollen 1,7,8,9,10,11,12,13 beschrieben.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des Astrozytengebietsvolumens von Mäusegehirnen mit fluoreszierender Markierung in einer spärlichen Population von Astrozyten (Abbildung 1). Da der durchschnittliche Durchmesser eines Astrozyten im Mauskortex etwa 60 μm beträgt, werden 100 μm dicke Abschnitte verwendet, um die Effizienz bei der Erfassung einzelner Astrozyten in ihrer Gesamtheit zu verbessern. Eine Immunfärbung ist nicht erforderlich, wird jedoch empfohlen, um das endogene Fluoreszenzsignal für die konfokale Bildgebung und Analyse zu verstärken. Die Immunfärbung kann auch einen besseren Nachweis von feinen Astrozytenzweigen ermöglichen und die Photobleiche von endogenen Proteinen während der Bildaufnahme reduzieren. Um das Eindringen von Antikörpern in die dicken Abschnitte zu verbessern und das Gewebevolumen vom Schneiden durch Bildgebung zu erhalten, werden frei schwebende Gewebeabschnitte verwendet. Die Analyse des Astrozytengebietsvolumens wird mit handelsüblicher Bildanalysesoftware durchgeführt. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur Analyse von Astrozytenkacheln in Gewebeabschnitten mit Mosaikmarkierung, bei der benachbarte Astrozyten unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen exprimieren. Dieses Protokoll wurde in mehreren neueren Studien ^1,8,9 erfolgreich verwendet^, um das Astrozytenwachstum während der normalen Gehirnentwicklung sowie die Auswirkungen der genetischen Manipulation auf die Astrozytenentwicklung zu charakterisieren.