Summary

Astrosit Bölgesi Hacminin Analizi ve Kalın Serbest Yüzen Doku Kesitlerinde Döşeme

Published: April 20, 2022
doi:

Summary

Bu protokol, fare beyninin serbest yüzen doku bölümlerini bölümleme, boyama ve görüntüleme yöntemlerini açıklar, ardından astrosit bölgesi hacminin ve astrosit bölgesi örtüşmesinin veya döşemesinin analizinin ayrıntılı bir açıklaması gelir.

Abstract

Astrositler, beyindeki hemen hemen her tür hücre ve yapı ile etkileşime girmelerini sağlayan şaşırtıcı derecede morfolojik karmaşıklığa sahiptir. Bu etkileşimler sayesinde, astrositler sinaps oluşumu, nörotransmisyon ve iyon homeostazı dahil olmak üzere birçok kritik beyin fonksiyonunu aktif olarak düzenler. Kemirgen beyninde, astrositler doğum sonrası ilk üç hafta boyunca boyut ve karmaşıklık bakımından büyür ve beyni döşemek için farklı, örtüşmeyen bölgeler oluşturur. Bu protokol, fare beyninden serbest yüzen doku kesitleri kullanarak astrosit bölgesi hacmini ve astrosit döşemesini analiz etmek için yerleşik bir yöntem sağlar. İlk olarak, bu protokol serbest yüzen doku kesitlerinin doku toplanması, kriyoseksiyonu ve immün boyama adımlarını açıklar. İkincisi, bu protokol, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımını kullanarak astrosit bölgesi hacminin ve bölge örtüşme hacminin görüntü alımını ve analizini açıklar. Son olarak, bu makale bu yöntemlerin avantajlarını, önemli hususlarını, ortak tuzaklarını ve sınırlamalarını tartışmaktadır. Bu protokol, astrositlerin seyrek veya mozaik floresan etiketlemeli beyin dokusunu gerektirir ve ortak laboratuvar ekipmanı, konfokal mikroskopi ve ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

Introduction

Astrositler, beyinde birçok önemli işlevi yerine getiren özenle dallanmış hücrelerdir1. Fare korteksinde, radyal glial kök hücreler, geç embriyonik ve erken doğum sonrası aşamalarda astrositlere yol açar2. Doğum sonrası ilk üç hafta boyunca, astrositler boyut ve karmaşıklık bakımından büyür ve sinapslarla doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal geliştirir1. Aynı zamanda, astrositler komşu astrositlerle etkileşime girerek beynidöşemek için ayrık, örtüşmeyen bölgeler oluşturur 3, aynı zamanda boşluk kavşak kanalları4 aracılığıyla iletişimi sürdürür. Astrosit morfolojisi ve organizasyonu, hakaret veya yaralanma5’i takiben birçok hastalık durumunda bozulur ve bu süreçlerin uygun beyin fonksiyonu için önemini gösterir. Normal gelişim, yaşlanma ve hastalık sırasında astrosit morfolojik özelliklerinin analizi, astrosit biyolojisi ve fizyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, genetik manipülasyonu takiben astrosit morfolojisinin analizi, astrosit morfolojik karmaşıklığının kurulmasını ve sürdürülmesini yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları ayırt etmek için değerli bir araçtır.

Fare beynindeki astrosit morfolojisinin analizi, hem astrosit dallanma karmaşıklığı hem de astrosit döşemesi ile karmaşıktır. Astrosit-spesifik bir belirteç olarak ara filament glial fibriler asidik proteini (GFAP) kullanan antikor boyaması, sadece ana dalları yakalar ve astrosit morfolojik karmaşıklığını büyük ölçüde hafife alır1. Glutamat taşıyıcı 1 (GLT-1; slc1a2), glutamin sentetaz veya S100β gibi diğer hücreye özgü belirteçler, astrosit dalları6’yı etiketlemek için daha iyi bir iş çıkarır, ancak yeni bir sorun ortaya çıkarır. Astrosit bölgeleri büyük ölçüde örtüşmez, ancak periferik kenarlarda küçük bir örtüşme derecesi vardır. Dallanmanın karmaşıklığı nedeniyle, komşu astrositler aynı renkte etiketlendiğinde, bir astrositin nerede bittiğini ve diğerinin nerede başladığını ayırt etmek imkansızdır. Astrositlerin endojen floresan proteinlerle seyrek veya mozaik etiketlenmesi her iki sorunu da çözer: floresan işaretleyici, tüm dalları yakalamak için hücreyi doldurur ve komşularından ayırt edilebilen bireysel astrositlerin görüntülenmesine izin verir. Viral enjeksiyon, plazmid elektroporasyonu veya transgenik fare çizgileri dahil olmak üzere genetik manipülasyon olsun veya olmasın, astrositlerin seyrek floresan etiketlemesini sağlamak için birkaç farklı strateji kullanılmıştır. Bu stratejilerin uygulanmasına ilişkin ayrıntılar daha önce yayınlanmış çalışmalarda veprotokoller 1,7,8,9,10,11,12,13’te açıklanmıştır.

Bu makalede, seyrek bir astrosit popülasyonunda floresan etiketleme ile fare beyinlerinden astrosit bölgesi hacmini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Fare korteksindeki bir astrositin ortalama çapı yaklaşık 60 μm olduğundan, bireysel astrositleri bütünüyle yakalamadaki verimliliği artırmak için 100 μm kalınlığında bölümler kullanılır. İmmünoboyama gerekli değildir, ancak konfokal görüntüleme ve analiz için endojen floresan sinyalini arttırmak için önerilir. İmmün boyama ayrıca ince astrosit dallarının daha iyi tespit edilmesini sağlayabilir ve görüntü elde etme sırasında endojen proteinlerin fotobeyazlatmasını azaltabilir. Kalın kesitlere antikor penetrasyonunu arttırmak ve doku hacmini görüntüleme yoluyla kesitlemeden korumak için serbest yüzen doku kesitleri kullanılır. Astrosit bölgesi hacminin analizi, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Ek olarak, bu protokol, komşu astrositlerin farklı floresan etiketlerini ifade ettiği mozaik etiketli doku kesitlerinde astrosit döşemesinin analizi için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, normal beyin gelişimi sırasında astrosit büyümesini ve genetik manipülasyonun astrosit gelişimi üzerindeki etkisini karakterize etmek için 1,8,9 numaralı son çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır.

Protocol

Tüm fareler, Chapel Hill’deki Kuzey Carolina Üniversitesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Karşılaştırmalı Tıp Bölümü (IACUC protokol numarası 21-116.0) uyarınca kullanılmıştır. Bu deneyler için doğum sonrası 21. günde (P21) her iki cinsiyetten fareler kullanıldı. CD1 fareleri ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosu) ve MADM9 WT: WT ve MADM9 WT: KO fareleri daha önce9 olarak tanımlandı. NOT: Bu p…

Representative Results

Şekil 1, bu protokol için ana adımların ve iş akışının şematik bir taslağını sunmaktadır. Şekil 2 , bir yüzey oluşturmak, yüzeye yakın noktalar oluşturmak ve dışbükey bir gövde oluşturmak için görüntü analiz yazılımını kullanan önemli adımların ekran görüntülerini göstermektedir. Şekil 3 , astrosit bölgesi örtüşmesini/döşemesini belirlemek için bu tekniğin uygulanmasını göstermekte…

Discussion

Bu protokol, fare korteksindeki astrosit bölgesi hacmini ve astrosit döşemesini analiz etmek için kurulmuş bir yöntemi açıklar ve perfüzyonla başlayan ve görüntü analizi ile biten tüm önemli adımları detaylandırır. Bu protokol, seyrek veya mozaik bir astrosit popülasyonunda floresan proteinleri eksprese eden farelerden beyinler gerektirir. Bu gereksinimin dışında, bu protokol için her yaştan fare kullanılabilir, perfüzyon ayarlarında sadece küçük ayarlamalar yapılır ve gömme kalıbına e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Mikroskopi, kısmen NIH-NINDS Sinirbilim Merkezi Destek Hibe P30 NS045892 ve NIH-NICHD Zihinsel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Destek Hibe U54 HD079124’ün finansmanıyla desteklenen UNC Sinirbilim Mikroskopi Çekirdeğinde (RRID: SCR_019060) gerçekleştirildi. Şekil 1, BioRender.com ile oluşturulmuştur. Şekil 4’teki görüntüler ve veriler, yayımcının izniyle önceki bir yayın9’dan yeniden yazdırılmıştır.

Materials

#5 forceps Roboz RS-5045
1 mL TB Syringe Becton Dickinson (BD) 309623
10x TBS (tris-buffered saline) 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate Genesee Scientific 25-106MP
1x TBS 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate Genesee Scientific 25-107MP
30% Sucrose in TBS 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer 10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice Charles River 022
Collection vial for brains Fisher Scientific 03-337-20
Confocal acquisition software Olympous FV31S-SW
Confocal microscope Olympus FV3000RS
Coverslips Fisher Scientific 12544E
Cryostat Thermo Scientific CryoStar NX50
Cryostat blade Thermo Scientific 3052835
DAPI Invitrogen D1306
Embedding mold Polysciences 18646A-1
Freezing Medium 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody Aves Labs GFP1010
Glycerol Thermo Scientific 158920010
Goat anti-chicken 488 Invitrogen A-11039
Goat anti-rabbit 594 Invitrogen A11037
Goat Serum Gibco 16210064
Heparin Sigma-Aldrich H3149
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Imaris Bitplane N/A Version 9.8.0
MATLAB MathWorks N/A
Metal lunch tin AQUARIUS N/A From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol Sigma-Aldrich 152463
Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5921
Mouting medium 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish VWR 100491-940
N-propyl gallate Sigma-Aldrich 02370-100G
O.C.T. Fisher Scientific 23-730-571
Oil Olympus IMMOIL-F30CC Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6" Roboz RS-6820
Orbital platform shaker Fisher Scientific 88861043 Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush Bogrinuo N/A From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes"
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Pasteur pipet (5.75") VWR 14672-608
Pasteur pipet (9") VWR 14672-380
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541-500G
Razor blade Fisher Scientific 12-640
RFP antibody Rockland 600-401-379
Sectioning medium 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides VWR 48311-703
Sodium chrloide Fisher Scientific BP358-212
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
TBST (TBS + Triton X-100) 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet VWR 414004-002
Tri-bromoethanol Sigma-Aldrich T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Thermo Scientific 424570025
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Triton X-100 (high-quality) Fisher Scientific 50-489-120
XTSpotsConvexHull N/A N/A custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST 0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer 10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium

References

  1. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  2. Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
  3. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  4. Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
  5. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
  6. Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  7. Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
  8. Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
  9. Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
  10. Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
  11. Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
  12. Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
  13. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
  14. O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).

Play Video

Cite This Article
Eaker, A. R., Baldwin, K. T. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (182), e63804, doi:10.3791/63804 (2022).

View Video