تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية
Summary
يصف هذا البروتوكول طرق تقسيم وتلطيخ وتصوير أقسام الأنسجة العائمة الحرة في دماغ الفأر ، متبوعا بوصف مفصل لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتداخل أراضي الخلايا النجمية أو تبليطها.
Abstract
تمتلك الخلايا النجمية درجة مذهلة من التعقيد المورفولوجي الذي يمكنها من التفاعل مع كل نوع من الخلايا والبنية تقريبا داخل الدماغ. من خلال هذه التفاعلات ، تنظم الخلايا النجمية بنشاط العديد من وظائف الدماغ الحرجة ، بما في ذلك تكوين المشبك العصبي ، والنقل العصبي ، والتوازن الأيوني. في دماغ القوارض ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة وتنشئ مناطق متميزة وغير متداخلة لتجانب الدماغ. يوفر هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة من دماغ الفأر. أولا ، يصف هذا البروتوكول خطوات جمع الأنسجة ، والتقسيم بالتبريد ، والتلطيخ المناعي لأقسام الأنسجة العائمة الحرة. ثانيا، يصف هذا البروتوكول اكتساب الصور وتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وحجم تداخل الأراضي، باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة تجاريا. وأخيرا، تناقش هذه المخطوطة المزايا والاعتبارات الهامة والمزالق الشائعة والقيود المفروضة على هذه الأساليب. يتطلب هذا البروتوكول أنسجة المخ مع وضع علامات فلورية متفرقة أو فسيفسائية على الخلايا النجمية ، وهو مصمم للاستخدام مع معدات المختبر الشائعة ، والمجهر البؤري ، وبرامج تحليل الصور المتاحة تجاريا.
Introduction
الخلايا النجمية هي خلايا متفرعة بشكل متقن تؤدي العديد من الوظائف المهمة في الدماغ1. في قشرة الفأر ، تؤدي الخلايا الجذعية الدبقية الشعاعية إلى ظهور الخلايا النجمية خلال المراحل الجنينية المتأخرة والمبكرة بعد الولادة2. خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد ، وتطور الآلاف من الفروع الدقيقة التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي1. في الوقت نفسه ، تتفاعل الخلايا النجمية مع الخلايا النجمية المجاورة لإنشاء مناطق منفصلة وغير متداخلة لتجانب الدماغ3 ، مع الحفاظ على الاتصال عبر قنوات تقاطع الفجوة4. تتعطل مورفولوجيا الخلايا النجمية وتنظيمها في العديد من الحالات المرضية بعد الإهانة أو الإصابة5 ، مما يشير إلى أهمية هذه العمليات لوظائف الدماغ السليمة. يمكن أن يوفر تحليل الخصائص المورفولوجية للخلايا النجمية أثناء التطور الطبيعي والشيخوخة والمرض رؤى قيمة في بيولوجيا الخلايا النجمية وعلم وظائف الأعضاء. علاوة على ذلك ، يعد تحليل مورفولوجيا الخلايا النجمية بعد التلاعب الجيني أداة قيمة لتمييز الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم إنشاء وصيانة التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية.
تحليل مورفولوجيا الخلايا النجمية في دماغ الفأر معقد بسبب كل من تعقيد تفرع الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية. تلطيخ الأجسام المضادة باستخدام البروتين الحمضي الليفي الدبقي الخيطي الوسيط (GFAP) كعلامة خاصة بالخلايا النجمية يلتقط فقط الفروع الرئيسية ، ويقلل إلى حد كبير من التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية1. تقوم علامات أخرى خاصة بالخلايا مثل ناقل الغلوتامات 1 (GLT-1 ؛ slc1a2) أو جلوتامين سينثيتاز أو S100β بعمل أفضل في وضع العلامات على فروع الخلايا النجمية6 ، ولكنها تقدم مشكلة جديدة. مناطق الخلايا النجمية غير متداخلة إلى حد كبير ، ولكن توجد درجة صغيرة من التداخل عند الحواف الطرفية. بسبب تعقيد التفرع ، عندما يتم تصنيف الخلايا النجمية المجاورة بنفس اللون ، من المستحيل التمييز بين المكان الذي تنتهي فيه إحدى الخلايا النجمية وتبدأ الأخرى. إن وضع العلامات المتناثرة أو الفسيفسائية للخلايا النجمية مع البروتينات الفلورية الذاتية المنشأ يحل كلتا المشكلتين: تملأ علامة الفلورسنت الخلية لالتقاط جميع الفروع وتسمح بتصوير الخلايا النجمية الفردية التي يمكن تمييزها عن جيرانها. تم استخدام العديد من الاستراتيجيات المختلفة لتحقيق وضع العلامات الفلورية المتناثرة للخلايا النجمية ، مع أو بدون التلاعب الجيني ، بما في ذلك الحقن الفيروسي ، أو كهربية البلازميد ، أو خطوط الفئران المعدلة وراثيا. يتم وصف تفاصيل تنفيذ هذه الاستراتيجيات في الدراسات والبروتوكولات المنشورة سابقا1،7،8،9،10،11،12،13.
توضح هذه المقالة طريقة لقياس حجم مساحة الخلايا النجمية من أدمغة الفئران باستخدام وسم الفلورسنت في مجموعة متفرقة من الخلايا النجمية (الشكل 1). نظرا لأن متوسط قطر الخلايا النجمية في قشرة الفأر يبلغ حوالي 60 ميكرومتر ، يتم استخدام أقسام بسماكة 100 ميكرومتر لتحسين الكفاءة في التقاط الخلايا النجمية الفردية بالكامل. التلطيخ المناعي غير مطلوب ولكن يوصى به لتعزيز إشارة الفلورسنت الذاتية المنشأ للتصوير والتحليل البؤري. قد يتيح التلطيخ المناعي أيضا كشفا أفضل لفروع الخلايا النجمية الدقيقة ويقلل من التبييض الضوئي للبروتينات الداخلية أثناء الحصول على الصورة. لتحسين تغلغل الأجسام المضادة في الأقسام السميكة ، وللحفاظ على حجم الأنسجة من التقسيم من خلال التصوير ، يتم استخدام أقسام الأنسجة العائمة بحرية. يتم إجراء تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح تجاريا. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة لتحليل بلاط الخلايا النجمية في أقسام الأنسجة مع وضع علامات الفسيفساء ، حيث تعبر الخلايا النجمية المجاورة عن تسميات فلورية مختلفة. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح في العديد من الدراسات الحديثة1،8،9 لتوصيف نمو الخلايا النجمية أثناء نمو الدماغ الطبيعي ، وكذلك تأثير التلاعب الجيني على تطور الخلايا النجمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية في قشرة الفأر ، مع تفصيل جميع الخطوات الرئيسية التي تبدأ بالتروية وتنتهي بتحليل الصور. يتطلب هذا البروتوكول أدمغة من الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية في مجموعة متفرقة أو فسيفساء من الخلايا ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء الفحص المجهري في مركز UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) ، مدعوما جزئيا بتمويل من منحة دعم مركز العلوم العصبية NIH-NINDS P30 NS045892 ومنحة دعم مركز أبحاث الإعاقات الفكرية والتنموية التابع للمعاهد الوطنية للصحة النباتية – NICHD U54 HD079124. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. تتم إعادة طباعة الصور والبيانات الواردة في الشكل 4 من منشور سابق9 بإذن من الناشر.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
