ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטות לחתך, צביעה והדמיה של מקטעי רקמה צפים בחופשיות במוח העכבר, ולאחר מכן תיאור מפורט של ניתוח נפח טריטוריית האסטרוציטים וחפיפת שטח האסטרוציטים או הריצוף.
Abstract
לאסטרוציטים יש מידה מדהימה של מורכבות מורפולוגית המאפשרת להם לתקשר כמעט עם כל סוג של תא ומבנה במוח. באמצעות אינטראקציות אלה, אסטרוציטים מווסתים באופן פעיל תפקודי מוח קריטיים רבים, כולל היווצרות סינפסות, העברה עצבית והומאוסטזיס של יונים. במוח המכרסמים, אסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה ויוצרים טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחף את המוח. פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת לניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים באמצעות מקטעי רקמה צפים בחופשיות ממוח העכבר. ראשית, פרוטוקול זה מתאר את השלבים לאיסוף רקמות, קריו-אקטציה ושמירה חיסונית של מקטעי רקמה צפים בחופשיות. שנית, פרוטוקול זה מתאר רכישת תמונות וניתוח של נפח שטח אסטרוציטים ונפח חפיפת שטח, באמצעות תוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית. לבסוף, כתב יד זה דן ביתרונות, בשיקולים החשובים, במלכודות הנפוצות ובמגבלות של שיטות אלה. פרוטוקול זה דורש רקמת מוח עם תיוג פלואורסצנטי דליל או פסיפס של אסטרוציטים, והוא מיועד לשימוש עם ציוד מעבדה משותף, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית.
Introduction
אסטרוציטים הם תאים מסועפים בצורה משוכללת המבצעים תפקודים חשובים רבים במוח1. בקליפת המוח של העכבר, תאי גזע גליאליים רדיאליים מעוררים אסטרוציטים בשלב העוברי המאוחר ובשלבים המוקדמים שלאחר הלידה2. במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה, האסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם, ומפתחים אלפי ענפים עדינים המתקשרים ישירות עם סינפסות1. במקביל, אסטרוציטים מקיימים אינטראקציה עם אסטרוציטים שכנים כדי ליצור טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחוץ את המוח3, תוך שמירה על תקשורת באמצעות ערוצי צומת פער4. המורפולוגיה והארגון של אסטרוציטים משתבשים במצבי מחלה רבים בעקבות עלבון או פציעה5, מה שמעיד על חשיבותם של תהליכים אלה לתפקוד תקין של המוח. ניתוח תכונות מורפולוגיות של אסטרוציטים במהלך התפתחות תקינה, הזדקנות ומחלות יכול לספק תובנות חשובות על ביולוגיה ופיזיולוגיה של אסטרוציטים. יתר על כן, ניתוח מורפולוגיה של אסטרוציטים בעקבות מניפולציה גנטית הוא כלי רב ערך להבחנה במנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בהקמה ובתחזוקה של מורכבות מורפולוגית של אסטרוציטים.
ניתוח המורפולוגיה של אסטרוציטים במוח העכבר מסובך הן על ידי מורכבות הסתעפות האסטרוציטים והן על ידי ריצוף האסטרוציטים. צביעת נוגדנים באמצעות החלבון החומצי של נגיף גליה (GFAP) כסמן ספציפי לאסטרוציטים לוכדת רק את הענפים העיקריים, וממעיטה במידה ניכרת במורכבות המורפולוגיתשל האסטרוציטים 1. סמנים ספציפיים לתאים אחרים כגון גלוטמט טרנספורטר 1 (GLT-1; slc1a2), גלוטמין סינטאז או S100β עושים עבודה טובה יותר בתיוג ענפי אסטרוציטים6, אך מציגים בעיה חדשה. שטחי אסטרוציטים אינם חופפים ברובם, אך קיימת מידה קטנה של חפיפה בקצוות ההיקפיים. בגלל המורכבות של הסתעפות, כאשר אסטרוציטים שכנים מסומנים באותו צבע, אי אפשר להבחין היכן מסתיים אסטרוציט אחד והשני מתחיל. תיוג דליל או פסיפס של אסטרוציטים עם חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגניים פותר את שתי הבעיות: הסמן הפלואורסצנטי ממלא את התא כדי ללכוד את כל הענפים ומאפשר הדמיה של אסטרוציטים בודדים שניתן להבחין ביניהם לבין שכניהם. מספר אסטרטגיות שונות שימשו להשגת תיוג פלואורסצנטי דליל של אסטרוציטים, עם או בלי מניפולציה גנטית, כולל הזרקה נגיפית, אלקטרופורציה של פלסמיד או קווי עכברים מהונדסים. פרטים על ביצוע אסטרטגיות אלה מתוארים במחקרים ופרוטוקולים שפורסמו בעבר 1,7,8,9,9,10,11,12,13.
מאמר זה מתאר שיטה למדידת נפח טריטוריית אסטרוציטים ממוחות של עכברים באמצעות תיוג פלואורסצנטי באוכלוסייה דלילה של אסטרוציטים (איור 1). מאחר שהקוטר הממוצע של אסטרוציט בקליפת המוח של העכבר הוא כ-60 מיקרומטר, חלקים בעובי של 100 מיקרומטר משמשים לשיפור היעילות בלכידת אסטרוציטים בודדים בשלמותם. חיסון אינו נדרש, אך מומלץ לשפר את האות הפלואורסצנטי האנדוגני להדמיה וניתוח קונפוקליים. חיסון עשוי גם לאפשר זיהוי טוב יותר של ענפי אסטרוציטים עדינים ולהפחית את ההלבנה הפוטו-אקונומית של חלבונים אנדוגניים במהלך רכישת התמונה. כדי לשפר את חדירת הנוגדנים למקטעים העבים, וכדי לשמור על נפח הרקמה מחתך דרך הדמיה, נעשה שימוש בקטעי רקמות צפים בחופשיות. ניתוח נפח שטח אסטרוציטים מבוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה מסחרית. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח ריצוף אסטרוציטים בקטעי רקמות עם תיוג פסיפס, שבו אסטרוציטים שכנים מבטאים תוויות פלואורסצנטיות שונות. פרוטוקול זה שימש בהצלחה במספר מחקרים אחרונים 1,8,9 כדי לאפיין את צמיחת האסטרוציטים במהלך התפתחות המוח התקינה, כמו גם את ההשפעה של מניפולציה גנטית על התפתחות אסטרוציטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת לניתוח נפח שטח אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים בקליפת המוח של העכבר, המפרט את כל השלבים העיקריים המתחילים בזלוף ומסתיימים בניתוח תמונה. פרוטוקול זה דורש מוחות מעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים באוכלוסייה דלילה או פסיפס של אסטרוציטים. מחוץ לדרישה זו, ניתן ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מיקרוסקופיה בוצעה בליבת המיקרוסקופיה של UNC Neuroscience (RRID:SCR_019060), הנתמכת בחלקה על ידי מימון ממענק התמיכה של מרכז מדעי המוח NIH-NINDS P30 NS045892 ומענק התמיכה של מרכז המחקר למוגבלויות שכליות והתפתחותיות של NIH-NIH-NICHD U54 HD079124. איור 1 נוצר עם BioRender.com. התמונות והנתונים באיור 4 מודפסים מחדש מפרסום קודם9 באישור המו”ל.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
