Summary

ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות

Published: April 20, 2022
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות לחתך, צביעה והדמיה של מקטעי רקמה צפים בחופשיות במוח העכבר, ולאחר מכן תיאור מפורט של ניתוח נפח טריטוריית האסטרוציטים וחפיפת שטח האסטרוציטים או הריצוף.

Abstract

לאסטרוציטים יש מידה מדהימה של מורכבות מורפולוגית המאפשרת להם לתקשר כמעט עם כל סוג של תא ומבנה במוח. באמצעות אינטראקציות אלה, אסטרוציטים מווסתים באופן פעיל תפקודי מוח קריטיים רבים, כולל היווצרות סינפסות, העברה עצבית והומאוסטזיס של יונים. במוח המכרסמים, אסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה ויוצרים טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחף את המוח. פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת לניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים באמצעות מקטעי רקמה צפים בחופשיות ממוח העכבר. ראשית, פרוטוקול זה מתאר את השלבים לאיסוף רקמות, קריו-אקטציה ושמירה חיסונית של מקטעי רקמה צפים בחופשיות. שנית, פרוטוקול זה מתאר רכישת תמונות וניתוח של נפח שטח אסטרוציטים ונפח חפיפת שטח, באמצעות תוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית. לבסוף, כתב יד זה דן ביתרונות, בשיקולים החשובים, במלכודות הנפוצות ובמגבלות של שיטות אלה. פרוטוקול זה דורש רקמת מוח עם תיוג פלואורסצנטי דליל או פסיפס של אסטרוציטים, והוא מיועד לשימוש עם ציוד מעבדה משותף, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית.

Introduction

אסטרוציטים הם תאים מסועפים בצורה משוכללת המבצעים תפקודים חשובים רבים במוח1. בקליפת המוח של העכבר, תאי גזע גליאליים רדיאליים מעוררים אסטרוציטים בשלב העוברי המאוחר ובשלבים המוקדמים שלאחר הלידה2. במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה, האסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם, ומפתחים אלפי ענפים עדינים המתקשרים ישירות עם סינפסות1. במקביל, אסטרוציטים מקיימים אינטראקציה עם אסטרוציטים שכנים כדי ליצור טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחוץ את המוח3, תוך שמירה על תקשורת באמצעות ערוצי צומת פער4. המורפולוגיה והארגון של אסטרוציטים משתבשים במצבי מחלה רבים בעקבות עלבון או פציעה5, מה שמעיד על חשיבותם של תהליכים אלה לתפקוד תקין של המוח. ניתוח תכונות מורפולוגיות של אסטרוציטים במהלך התפתחות תקינה, הזדקנות ומחלות יכול לספק תובנות חשובות על ביולוגיה ופיזיולוגיה של אסטרוציטים. יתר על כן, ניתוח מורפולוגיה של אסטרוציטים בעקבות מניפולציה גנטית הוא כלי רב ערך להבחנה במנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בהקמה ובתחזוקה של מורכבות מורפולוגית של אסטרוציטים.

ניתוח המורפולוגיה של אסטרוציטים במוח העכבר מסובך הן על ידי מורכבות הסתעפות האסטרוציטים והן על ידי ריצוף האסטרוציטים. צביעת נוגדנים באמצעות החלבון החומצי של נגיף גליה (GFAP) כסמן ספציפי לאסטרוציטים לוכדת רק את הענפים העיקריים, וממעיטה במידה ניכרת במורכבות המורפולוגיתשל האסטרוציטים 1. סמנים ספציפיים לתאים אחרים כגון גלוטמט טרנספורטר 1 (GLT-1; slc1a2), גלוטמין סינטאז או S100β עושים עבודה טובה יותר בתיוג ענפי אסטרוציטים6, אך מציגים בעיה חדשה. שטחי אסטרוציטים אינם חופפים ברובם, אך קיימת מידה קטנה של חפיפה בקצוות ההיקפיים. בגלל המורכבות של הסתעפות, כאשר אסטרוציטים שכנים מסומנים באותו צבע, אי אפשר להבחין היכן מסתיים אסטרוציט אחד והשני מתחיל. תיוג דליל או פסיפס של אסטרוציטים עם חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגניים פותר את שתי הבעיות: הסמן הפלואורסצנטי ממלא את התא כדי ללכוד את כל הענפים ומאפשר הדמיה של אסטרוציטים בודדים שניתן להבחין ביניהם לבין שכניהם. מספר אסטרטגיות שונות שימשו להשגת תיוג פלואורסצנטי דליל של אסטרוציטים, עם או בלי מניפולציה גנטית, כולל הזרקה נגיפית, אלקטרופורציה של פלסמיד או קווי עכברים מהונדסים. פרטים על ביצוע אסטרטגיות אלה מתוארים במחקרים ופרוטוקולים שפורסמו בעבר 1,7,8,9,9,10,11,12,13.

מאמר זה מתאר שיטה למדידת נפח טריטוריית אסטרוציטים ממוחות של עכברים באמצעות תיוג פלואורסצנטי באוכלוסייה דלילה של אסטרוציטים (איור 1). מאחר שהקוטר הממוצע של אסטרוציט בקליפת המוח של העכבר הוא כ-60 מיקרומטר, חלקים בעובי של 100 מיקרומטר משמשים לשיפור היעילות בלכידת אסטרוציטים בודדים בשלמותם. חיסון אינו נדרש, אך מומלץ לשפר את האות הפלואורסצנטי האנדוגני להדמיה וניתוח קונפוקליים. חיסון עשוי גם לאפשר זיהוי טוב יותר של ענפי אסטרוציטים עדינים ולהפחית את ההלבנה הפוטו-אקונומית של חלבונים אנדוגניים במהלך רכישת התמונה. כדי לשפר את חדירת הנוגדנים למקטעים העבים, וכדי לשמור על נפח הרקמה מחתך דרך הדמיה, נעשה שימוש בקטעי רקמות צפים בחופשיות. ניתוח נפח שטח אסטרוציטים מבוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה מסחרית. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח ריצוף אסטרוציטים בקטעי רקמות עם תיוג פסיפס, שבו אסטרוציטים שכנים מבטאים תוויות פלואורסצנטיות שונות. פרוטוקול זה שימש בהצלחה במספר מחקרים אחרונים 1,8,9 כדי לאפיין את צמיחת האסטרוציטים במהלך התפתחות המוח התקינה, כמו גם את ההשפעה של מניפולציה גנטית על התפתחות אסטרוציטים.

Protocol

כל העכברים שימשו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ’אפל היל והמחלקה לרפואה השוואתית (פרוטוקול IACUC מספר 21-116.0). עכברים משני המינים ביום 21 שלאחר הלידה (P21) שימשו לניסויים אלה. עכברי CD1 הושגו באופן מסחרי (טבלת חומרים), ועכברי MADM9 WT:WT:WT ו-MADM9 WT:KO ?…

Representative Results

איור 1 מציג חלוקה סכמטית של השלבים העיקריים וזרימת העבודה עבור פרוטוקול זה. איור 2 מציג צילומי מסך של שלבים מרכזיים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה כדי ליצור משטח, ליצור כתמים קרובים לפני השטח וליצור גוף קמור. איור 3 מדגים את היישום של טכניקה זו כד…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת לניתוח נפח שטח אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים בקליפת המוח של העכבר, המפרט את כל השלבים העיקריים המתחילים בזלוף ומסתיימים בניתוח תמונה. פרוטוקול זה דורש מוחות מעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים באוכלוסייה דלילה או פסיפס של אסטרוציטים. מחוץ לדרישה זו, ניתן ל?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מיקרוסקופיה בוצעה בליבת המיקרוסקופיה של UNC Neuroscience (RRID:SCR_019060), הנתמכת בחלקה על ידי מימון ממענק התמיכה של מרכז מדעי המוח NIH-NINDS P30 NS045892 ומענק התמיכה של מרכז המחקר למוגבלויות שכליות והתפתחותיות של NIH-NIH-NICHD U54 HD079124. איור 1 נוצר עם BioRender.com. התמונות והנתונים באיור 4 מודפסים מחדש מפרסום קודם9 באישור המו”ל.

Materials

#5 forceps Roboz RS-5045
1 mL TB Syringe Becton Dickinson (BD) 309623
10x TBS (tris-buffered saline) 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate Genesee Scientific 25-106MP
1x TBS 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate Genesee Scientific 25-107MP
30% Sucrose in TBS 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer 10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice Charles River 022
Collection vial for brains Fisher Scientific 03-337-20
Confocal acquisition software Olympous FV31S-SW
Confocal microscope Olympus FV3000RS
Coverslips Fisher Scientific 12544E
Cryostat Thermo Scientific CryoStar NX50
Cryostat blade Thermo Scientific 3052835
DAPI Invitrogen D1306
Embedding mold Polysciences 18646A-1
Freezing Medium 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody Aves Labs GFP1010
Glycerol Thermo Scientific 158920010
Goat anti-chicken 488 Invitrogen A-11039
Goat anti-rabbit 594 Invitrogen A11037
Goat Serum Gibco 16210064
Heparin Sigma-Aldrich H3149
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Imaris Bitplane N/A Version 9.8.0
MATLAB MathWorks N/A
Metal lunch tin AQUARIUS N/A From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol Sigma-Aldrich 152463
Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5921
Mouting medium 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish VWR 100491-940
N-propyl gallate Sigma-Aldrich 02370-100G
O.C.T. Fisher Scientific 23-730-571
Oil Olympus IMMOIL-F30CC Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6" Roboz RS-6820
Orbital platform shaker Fisher Scientific 88861043 Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush Bogrinuo N/A From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes"
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Pasteur pipet (5.75") VWR 14672-608
Pasteur pipet (9") VWR 14672-380
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541-500G
Razor blade Fisher Scientific 12-640
RFP antibody Rockland 600-401-379
Sectioning medium 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides VWR 48311-703
Sodium chrloide Fisher Scientific BP358-212
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
TBST (TBS + Triton X-100) 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet VWR 414004-002
Tri-bromoethanol Sigma-Aldrich T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Thermo Scientific 424570025
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Triton X-100 (high-quality) Fisher Scientific 50-489-120
XTSpotsConvexHull N/A N/A custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST 0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer 10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium

References

  1. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  2. Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
  3. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  4. Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
  5. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
  6. Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  7. Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
  8. Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
  9. Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
  10. Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
  11. Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
  12. Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
  13. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
  14. O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).

Play Video

Cite This Article
Eaker, A. R., Baldwin, K. T. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (182), e63804, doi:10.3791/63804 (2022).

View Video