ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

基底膜(BM)は、上皮構造および形態形成に重要な層状細胞付着性細胞外マトリックス(ECM)の薄いシート^である1。それは〜50のタンパク質を含み、上皮および内皮細胞の根底にある遍在的に見出され、そして骨格、平滑、および心筋細胞および脂肪細胞^を包み込む^1,2,3。上皮細胞の基底側にあるBMの3つの主要成分は、コラーゲンIV、ペルレカン、およびラミニンである。BMは上皮細胞の根底にあり、組織の分離と障壁、成長と支持、細胞分極²、³、⁴、⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、12を含む多くの機能を担当し^ています。.シグナル伝達プラットフォームとしてのその役割は、発生中の上皮細胞および組織の形態および分化を調節する³、^13、14。さらに、BMの誤った調節および/またはその完全性の侵害は、腫瘍転移を含む多くの病理学的状態の主な原因である2,15,16。組織および器官の形態形成中にBMによって実行される本質的な機能にもかかわらず、BMタンパク質の分極細胞内輸送および分泌に捧げられた生物学的経路の構成要素は漠然と知られている。

BM含有小胞の細胞内輸送および上皮細胞によるBMタンパク質の分泌を研究するために、ショウジョウバエ卵巣の濾胞上皮(FE)は強力なモデル系である(図1)。ショウジョウバエの卵巣は、卵巣と呼ばれる16〜20個の長い管状の構造を含む(図1A、B)¹⁷、¹⁸、¹⁹。各卵巣は卵組立ラインと考えることができ、成熟した卵が卵管を通って出るまで、前端から始まり後方に移動する卵室(それぞれが卵を生じる)の年齢進行を伴う。各卵室は、中央生殖細胞系列細胞(GC)を囲む体細胞卵胞細胞(FC)の単層であるFEによってカプセル化されている。FEは、頂端ドメインが生殖細胞系列に面し、BMタンパク質が基底的に分泌される明確な頂端 – 基底極性で高度に分極している^18,19。FCは、コラーゲンIV、ペルレカン、ラミニン^20,21を含むBMの主要成分のすべてを積極的に分泌^します。FCなどの上皮細胞では、BM成分が産生され、細胞外に沈着するために特殊な分極分泌経路を必要とする。例えば、BMの最も豊富な成分であるコラーゲンIV(Coll IV)の場合、その産生および沈着が多くの研究の焦点であるにもかかわらず、その分極した細胞内輸送および分泌を取り巻く詳細は曖昧である。コルIVは小胞体(ER)に翻訳され、ここでも各線維−3つのポリペプチド(2つのα1鎖および1つのα2鎖)からなる−が三重らせん²²に組み立てられる。適切なコルIVの折り畳みおよび機能には、PlodおよびPH4αEFB^20、22、²³、24、^25、26などのリジルおよびプロリルヒドロキシラーゼを含むERシャペロンおよび酵素が必要である。これらの翻訳後酵素は、それぞれの喪失がコルIVを基底ER 20、23、²⁴、^25、26に捕捉させるので、コルIVのER選別を調節する。次いで、新たに合成されたコルIVは、COPII被覆小胞においてゴルジ体に対するERを出る。貨物受容体Tango1は、コラーゲンを大きな多量体タンパク質を収容できる大きなゴルジ結合小胞に包装するのに役立ちます^20,27。Coll IVが細胞内外膠細胞小胞にパッケージ化されると、上皮細胞から基底的に特異的に分泌される。BM沈着を基底側に向けるために、上皮細胞は、偏光BM分泌に特異的に捧げられた別の因子セットを必要とする。ショウジョウバエ卵巣のFEを用いて、ヌクレオチド交換因子(GEF)CragおよびStratum、GTPaseRab8およびRab10、ならびにホスホイノシチドPI(4,5)P2、ならびにキネシン1および3モータータンパク質20、28、29、^30、31のレベルを含む、この新規な細胞プロセスのいくつかの成分が特徴付けられている20、²⁸、^29、30、31.これらの成分は、BMタンパク質の偏光分布を確実にする上で重要である。

FEにおけるBMタンパク質の細胞内局在をモニターするために、内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質(タンパク質トラップ)、例えばバイキング−GFP(Vkg−GFPまたはα2コールIV−GFP)およびペルレカン−GFP(Pcan−GFP)^32、33を使用することができる。これらのタンパク質トラップラインは、BMタンパク質の内因性分布を正確に反映し、小胞トラフィッキングのより高感度な検出を可能にすることが示されている^28,30。FEにおけるBMの偏光沈着に関与する成分は、Vkg−GFPおよびPcan−GFP20、^28、29、30についてのタンパク質トラップラインを用いて最初に特徴付けられた。タンパク質トラップは、変異体およびGal4系統³⁴を含む異なる遺伝的背景において使用することができる。さらに、タンパク質トラップを蛍光色素および/または蛍光免疫染色と組み合わせて使用することができ、野生型および変異型条件を比較する際にBMタンパク質の局在の正確な特性評価を可能にする³⁵。

BMタンパク質含有小胞の分布および局在を正確かつ効率的に評価するために、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)および超解像イメージング技術は、他のイメージングアプローチに大きな利点を提示する。これらのアプローチは、高解像度イメージングと比較的使いやすさを兼ね備えています。CLSMは、ガルバノメータを使用してラスタースキャン方式で試料をレーザーでスキャンすることにより、光学分解能を向上させる顕微鏡技術です。ピンホール開口部は、共焦点顕微鏡のコアコンポーネントです。焦点面の上または下から来る焦点ずれ信号を遮断することによって、ピンホール開口部は、z軸³⁶において非常に優れた分解能をもたらす。これはまた、一連の光学セクションに対応するzスタックと呼ばれるz平面内の一連の画像を得ることを可能にする。zスタックはその後、イメージングソフトウェアの助けを借りて、3D再構成を介して標本の3D画像を作成します。従来の落射蛍光(広視野)顕微鏡は、共焦点顕微鏡とは異なり、焦点の合わない光が画質に寄与し、画像の解像度とコントラストを低下させる^36,37。これにより、落射蛍光顕微鏡は、タンパク質の局在化または共局在を研究する際の魅力の低い候補になります。

CLSMは、BMタンパク質の細胞内輸送のイメージングや特性評価など、さまざまなアプリケーションに適したアプローチですが、アッベの回折限界(200-250nm)未満のサンプルをイメージングする場合、依然として問題となります。このようなサンプルを画像化する場合、共焦点顕微鏡は、特にオイル対物レンズを使用する場合、高解像度をもたらし得る。しかし、超解像技術は共焦点顕微鏡の限界を超えています。超解像顕微鏡法を実現するにはさまざまなアプローチがあり、それぞれに特定の分解能限界があり、それぞれが異なる分析に適しています。これらのアプローチには、光活性化局在化顕微鏡(PALM)または確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、誘導放出枯渇顕微鏡(STED)、構造化照明顕微鏡(SIM)、およびエアリスキャン(超解像)顕微鏡³⁸、³⁹、40、⁴¹、^42、43、⁴⁴、^45、46が含まれる。.Airyscanの解像度はPALM/STORM、STED、SIMよりも粗いですが、最大120nm(CLSMの約2倍の解像度)の解像度を達成できます。さらに、この超解像顕微鏡アプローチは、厚いサンプルおよび低い信号対雑音比のサンプルをイメージングする際に、SIMおよび他の超解像技術よりも有利であることが示されている^47,48。

Airyscanは、比較的新しい超解像共焦点顕微鏡技術⁴⁶である。ピンホール検出器とシングルポイント検出器を使用して焦点の合っていない光を除去する従来のCLSMとは異なり、この超解像アプローチは、すべてのスキャン位置⁴⁵ですべての光を収集する32チャンネルガリウム砒素リン化物(GaAsP)光電子増倍管面積検出器を使用します。32個の検出器のそれぞれは小さなピンホールとして機能し、ピンホールのサイズを従来の1.0エアリーユニット(A.U.)から強化された0.2A.U.に縮小し、直径1.25A.U.の効率を維持しながら、さらに高い分解能と信号対雑音比を可能にします⁴⁵。さらに、Airyscanで使用される線形デコンボリューションは、分解能⁴⁵を最大2倍増加させます。これを考慮に入れると、CLSM、特に超解像顕微鏡は、局在化および共局在研究のための非常に高い解像度の画像を生成することができるため、BMタンパク質およびBMタンパク質の基礎沈着を調節するタンパク質の研究に適しており、それによってこれらのプロセスを制御する空間的、時間的、および分子的事象に新しい洞察を提供する。

局在化実験の実行に使用できる共焦点顕微鏡の代替アプローチは、画像デコンボリューションである。広視野顕微鏡は、焦点の合っていない光が検出器に到達することを可能にするので、広視野顕微鏡によって得られた画像から焦点の合っていない光を除去または再割り当てするために、数学的および計算的デコンボリューションアルゴリズムを適用することができ、それによって、画像⁴⁹の解像度およびコントラストを改善することができる。デコンボリューションアルゴリズムは、共焦点画像にも適用して、解像度およびコントラストをさらに高め、超解像顕微鏡⁵⁰のそれにほぼ匹敵する最終画像を生成することができる。Airyscanは、シェパードのピクセル再割り当てとともにワイナーフィルタベースのデコンボリューションを利用し、空間分解能と信号対雑音比を大幅に改善します。共焦点顕微鏡と比較して、この超解像顕微鏡技術を使用すると、3つの空間寸法(xおよびyで120nm、zで350nm)すべてで分解能が2倍の増加が観察される^45,51。

この原稿は、 ショウジョウバエ 卵巣のFEを共焦点および超解像顕微鏡と組み合わせたモデルシステムとして使用して、BMタンパク質の細胞内輸送および沈着を染色、取得、および視覚化するための詳細かつ最適化されたプロトコルを提供する。内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質、例えばVkg−GFPおよびPcan−GFPを発現する ショウジョウバエ 系統は、BMタンパク質の輸送および分泌を視覚化するための効率的かつ正確なツールである。さらに、それらは、突然変異体および Gal4/UAS 系統³⁴を含む異なる遺伝的背景において容易に使用することができる。内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質が推奨されるが、特定のBMタンパク質に対する抗体の使用もまた、記載されたプロトコールと適合性がある。これらのプロトコルは、共焦点および超解像イメージングを使用して、細胞内輸送および無傷の上皮組織におけるBMタンパク質の分泌を研究することに関心のある科学者にとって特に有用である。さらに、上皮組織分析と ショウジョウバエ 遺伝学の広範なツールを組み合わせる能力は、このアプローチを特に強力にします。最後に、これらのプロトコルは、水疱輸送および関心のある他のタンパク質の選別を研究するために容易に適合させることができる。