קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.
קרום המרתף (BM) – יריעה מיוחדת של מטריצה חוץ-תאית הקיימת בצד הבסיסי של תאי אפיתל – חיונית לביסוס ותחזוקה של מורפולוגיה של רקמת אפיתל ומורפוגנזה של איברים. יתר על כן, ה- BM חיוני למידול רקמות, משמש כפלטפורמת איתות, ומספק כוחות חיצוניים לעיצוב רקמות ואיברים. למרות התפקידים החשובים הרבים שה-BM ממלא במהלך ההתפתחות התקינה והתנאים הפתולוגיים, המסלולים הביולוגיים השולטים בסחר התוך-תאי של שלפוחיות המכילות BM וכיצד הפרשה בסיסית מובילה לתצהיר מקוטב של חלבוני BM אינם מובנים היטב. האפיתל הזקיק של השחלה דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוינת לחקר התצהיר הבסיסי של חלבוני ממברנת BM, שכן הוא מייצר ומפריש את כל המרכיבים העיקריים של BM. הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה בשילוב עם עיבוד תמונה ברקמות קבועות מאפשרת זיהוי ואפיון של גורמים תאיים המעורבים במיוחד בסחר תוך תאי ובתצהיר של חלבוני BM. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצביעה והדמיה של בועיות המכילות BM ו- BM מופקד באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני באפיתל הזקיקי של שחלת דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לענות על שאלות איכותיות וכמותיות כאחד והוא פותח כדי להתאים לסינון בתפוקה גבוהה, המאפשר זיהוי מהיר ויעיל של גורמים המעורבים בסחר תוך תאי מקוטב ובהפרשה של שלפוחיות במהלך התפתחות רקמת אפיתל.
קרום המרתף (BM) הוא יריעה דקה של מטריצה חוץ-תאית דביקה של תאים מרובדים (ECM) הקריטית למבנה אפיתל ולמורפוגנזה1. הוא מכיל כ-50 חלבונים ונמצא בכל מקום ביסוד תאי האפיתל והאנדותל, ומעורר תא שלד, חלק ושריר לב ואדיפוציטים 1,2,3. שלושת המרכיבים העיקריים של ה-BM בצד הבסיסי של תאי האפיתל הם קולגן IV, פרלקן ולמינינים. ה-BM עומד בבסיס תאי האפיתל ואחראי על תפקודים רבים, כולל הפרדת רקמות ומחסום, גדילה ותמיכה, וקיטוב תאים 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . תפקידה כפלטפורמת איתות מווסת את המורפולוגיה וההתמיינות של תאי אפיתל ורקמות במהלך ההתפתחות 3,13,14. יתר על כן, ויסות שגוי של ה- BM ו / או הפרה בשלמותו הם הגורמים העיקריים למצבים פתולוגיים רבים, כולל גרורות גידול 2,15,16. למרות הפונקציות החיוניות המבוצעות על ידי BM במהלך מורפוגנזה של רקמות ואיברים, מרכיבי המסלולים הביולוגיים המוקדשים לסחר תוך-תאי מקוטב ולהפרשה של חלבוני BM ידועים במעורפל.
כדי לחקור את הסחר התוך-תאי של בועיות המכילות BM ואת הפרשת חלבוני BM על ידי תאי אפיתל, האפיתל הזקיקי (FE) של שחלת דרוזופילה הוא מערכת מודל רבת עוצמה (איור 1). שחלת דרוזופילה מורכבת מ-16-20 מבנים ארוכים דמויי צינור, הנקראים אובריולים (איור 1A,B)17,18,19. ניתן לחשוב על כל שחלות כפס ייצור של ביצים, עם התקדמות הגיל של תאי הביצה (שכל אחד מהם מוליד ביצה) שמתחיל בקצה הקדמי ונע לאחור, עד שהביצה הבוגרת יוצאת דרך האובידוקט. כל תא ביצית עטוף על ידי ה-FE, חד-שכבתי של תאי זקיק סומטיים (FCs), המקיף את תאי הנבט המרכזיים (GCs). ה-FE מקוטב מאוד עם קוטביות אפית-בסיסית מובהקת שבה התחום האפיקלי פונה אל הנבט, וחלבוני ה-BM מופרשים באופן בסיסי18,19. ה-FCs מפרישים באופן פעיל את כל המרכיבים העיקריים של ה-BM, כולל קולגן IV, פרלקן ולמינינים 20,21. בתאי אפיתל כגון FCs, רכיבי ה-BM מיוצרים ודורשים מסלול הפרשה מקוטב מיוחד עבור התצהיר שלהם חוץ-תאי. לדוגמה, במקרה של המרכיב הנפוץ ביותר של BM, קולגן IV (Coll IV), הפרטים סביב הסחר וההפרשה התוך-תאיים המקוטבים שלו מעורפלים למרות שהייצור והתצהיר שלו הם המוקד של מחקרים רבים. קול IV מתורגם ברשתית האנדופלסמית (ER), שבה כל פיבריל – המורכב משלושה פוליפפטידים (שתי שרשראות α1 ושרשרת α2 אחת) – מורכב לסליל משולש22. קיפול תקין של Coll IV ותפקוד דורשים מלווים ואנזימים של ER, כולל ליזיל ופרוליל-הידרוקסילאזות כגון Plod ו-PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. אנזימים פוסט-טרנסלציוניים אלה מווסתים את מיון ה-ER של קול IV, שכן האובדן של כל אחד מהם גורם ל-Coll IV להילכד ב-ER הבסיסי 20,23,24,25,26. לאחר מכן, הקולג’ הרביעי המסונתז החדש יוצא מהמיון עבור הגולגי בשלפוחיות מצופות COPII. קולטן המטען Tango1 מסייע באריזת קולגן לתוך שלפוחיות גדולות הקשורות לגולגי שיכולות להכיל חלבונים רב-חומריים גדולים20,27. ברגע ש-Coll IV נארז לתוך שלפוחיות אקסוציטיות תוך-תאיות, הוא מופרש באופן ספציפי באופן בסיסי מתאי אפיתל. כדי לכוון את תצהיר BM לצד הבסיסי, תאי אפיתל דורשים קבוצה נוספת של גורמים המוקדשים במיוחד להפרשת BM מקוטבת. באמצעות ה-FE של שחלת דרוזופילה, אופיינו כמה מרכיבים של התהליך התאי החדש הזה, כולל גורמי חילופי הנוקלאוטידים (GEFs) Crag ו-Stratum, ה-GTPases Rab8 ו-Rab10, כמו גם הרמות של הפוספונינוסיטיד PI(4,5)P2, ו-Kinesin 1 ו-3 חלבונים מוטוריים 20,28,29,30,31 . רכיבים אלה חיוניים להבטחת ההתפלגות המקוטבת של חלבוני BM.
כדי לנטר את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני BM ב-FE, חלבוני קרום מרתף המתויגים באופן אנדוגני (מלכודות חלבון), כגון Viking-GFP (Vkg-GFP או α2 Coll IV-GFP) ו-Perlecan-GFP (Pcan-GFP) יכולים לשמש32,33. הודגם כי קווי מלכודת חלבונים אלה משקפים במדויק את ההתפלגות האנדוגנית של חלבוני BM ומאפשרים זיהוי רגיש יותר של סחרבשלפוחית 28,30. הרכיבים המעורבים בתצהיר המקוטב של BM ב-FE אופיינו לראשונה באמצעות קווי מלכודת חלבונים עבור Vkg-GFP ו-Pcan-GFP 20,28,29,30. ניתן להשתמש במלכודות חלבונים ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטנטים וקווי Gal4 34. יתר על כן, ניתן להשתמש במלכודות חלבונים בשילוב עם צבעים פלואורסצנטיים ו/או חיסון פלואורסצנטי, מה שמאפשר אפיון מדויק של לוקליזציה של חלבוני BM כאשר משווים בין תנאים מסוג בר ומוטנטים35.
כדי להעריך באופן מדויק ויעיל את ההתפלגות והלוקליזציה של שלפוחיות המכילות חלבון BM, מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) וטכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד מהוות יתרון משמעותי לגישות הדמיה אחרות. גישות אלה משלבות הדמיה ברזולוציה גבוהה עם קלות שימוש יחסית. CLSM היא טכניקת מיקרוסקופיה המאפשרת רזולוציה אופטית משופרת על ידי סריקת הדגימה באמצעות לייזר באופן סריקת רסטר באמצעות גלוונומטרים. מפתח הצמצם של חור הפין הוא מרכיב מרכזי במיקרוסקופ קונפוקלי. על-ידי חסימת האותות מחוץ למיקוד המגיעים מעל או מתחת למישור המוקד, מפתח הצמצם של חור הפין מוביל לרזולוציה מעולה ביותר בציר z36. זה גם מאפשר לקבל סדרה של תמונות במישור z, הנקרא z-stack, המתאים לסדרה של קטעים אופטיים. z-stacks יוצרים לאחר מכן תמונה תלת-ממדית של הדגימה, באמצעות שחזור תלת-ממדי, בעזרת תוכנת הדמיה. מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים קונבנציונליים (שדה רחב), בניגוד למיקרוסקופים קונפוקליים, מאפשרים לאור מחוץ למיקוד לתרום לאיכות התמונה, ובכך להקטין את רזולוציית התמונה ואת הניגודיות36,37. זה הופך את מיקרוסקופיית האפיפלואורסצנציה למועמדת פחות אטרקטיבית כאשר חוקרים לוקליזציה של חלבונים או קולוקליזציה.
למרות ש-CLSM היא גישה מתאימה ליישומים שונים, כולל הדמיה ואפיון של הסחר התוך-תאי בחלבוני BM, היא עדיין מהווה בעיה בעת הדמיה של דגימות מתחת לגבול עקיפת האור של Abbe (200-250 ננומטר). בעת הדמיה של דגימות כאלה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, במיוחד בעת שימוש במטרת שמן, יכולה לגרום לרזולוציה גבוהה. עם זאת, טכניקות סופר-רזולוציה עוברות את הגבול של מיקרוסקופיה קונפוקלית. ישנן גישות שונות להשגת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, שלכל אחת מהן מגבלות רזולוציה ספציפיות, וכל אחת מהן מתאימה לניתוחים שונים. גישות אלה כוללות מיקרוסקופיית לוקליזציה פוטואקטיבית (PALM) או מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM) ומיקרוסקופיה אווירית (סופר-רזולוציה) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . למרות של-Airyscan יש רזולוציה גסה יותר מאשר PALM/STORM, STED ו-SIM, הוא עדיין יכול להשיג רזולוציה של עד ~120 ננומטר (בערך פי שניים מהרזולוציה של CLSM). יתר על כן, הודגם כי לגישת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה זו יש יתרון על פני SIM וטכניקות אחרות ברזולוציית-על בעת הדמיית דגימות ודגימות עבות עם יחס אות לרעש נמוך47,48.
Airyscan היא טכנולוגיית מיקרוסקופיה קונפוקלית חדשה יחסית ברזולוציה גבוההיחסית 46. בניגוד ל-CLSMs מסורתיים, המשתמשים ב-pinhole ובגלאי נקודה בודדת כדי לדחות אור מחוץ למיקוד, גישה זו של רזולוציית-על משתמשת בגלאי שטח שפופרת פוטומולטיפלייר (GaAsP) בעל 32 ערוצים של גליום ארסניד פוספיד (GaAsP) שאוסף את כל האור בכל מיקום סריקה45. כל אחד מ-32 הגלאים פועל כחור סיכה קטן, ומקטין את גודל חור הפין מיחידת ה-1.0 Airy Unit המסורתית (A.U.) ל-0.2 A.U. משופרת, מה שמאפשר רזולוציה גבוהה עוד יותר ויחס אות לרעש, תוך שמירה על היעילות של קוטר45 של 1.25 A.U. יתר על כן, הדה-קונבולוציה הליניארית המשמשת את Airyscan גורמת לעלייה של עד פי 2 ברזולוציה45. בהתחשב בכך, CLSM, ובמיוחד מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, מתאימים היטב לחקר חלבוני BM וחלבונים המווסתים את התצהיר הבסיסי של חלבוני BM, מכיוון שהם יכולים לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד למחקרי לוקליזציה וקולוקליזציה, ובכך לספק תובנות חדשות באירועים המרחביים, הזמניים והמולקולריים השולטים בתהליכים אלה.
גישה חלופית למיקרוסקופיה קונפוקלית שניתן להשתמש בה כדי לבצע ניסויי לוקליזציה היא דה-קונבולוציה של תמונות. מאחר שמיקרוסקופיית שדה רחב מאפשרת לאור מחוץ למיקוד להגיע לגלאים, ניתן ליישם אלגוריתמים מתמטיים וחישוביים של דקונבולוציה כדי להסיר או להקצות מחדש אור מחוץ למיקוד מתמונות המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה בשדה רחב, ובכך לשפר את הרזולוציה והניגודיות של התמונה49. ניתן ליישם אלגוריתמים של Deconvolution גם על תמונות קונפוקליות כדי להגדיל עוד יותר את הרזולוציה והניגודיות, ולהפיק תמונות סופיות כמעט דומות לאלה של מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה50. Airyscan עושה שימוש בפירוק מבוסס מסנן ויינר יחד עם הקצאת הפיקסלים מחדש של שפרד, וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש משופרים ביותר. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, נצפתה עלייה של פי 2 ברזולוציה בכל שלושת הממדים המרחביים (120 ננומטר ב-x וב-y, ו-350 ננומטר ב-z) בעת שימוש בטכניקת מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה זו45,51.
כתב יד זה מספק פרוטוקולים מפורטים וממוטבים לצביעה, רכישה והדגמה של סחר ותצהיר תוך-תאיים של חלבוני BM תוך שימוש ב-FE של שחלת דרוזופילה כמערכת מודל בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. קווי דרוזופילה המבטאים חלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, למשל Vkg-GFP ו-Pcan-GFP, הם כלים יעילים ומדויקים להמחשת סחר והפרשת חלבוני BM. בנוסף, ניתן להשתמש בהם בקלות ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטציה וקווי Gal4/UAS 34. למרות שמומלץ להשתמש בחלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, השימוש בנוגדנים נגד חלבוני BM ספציפיים תואם גם את הפרוטוקולים המתוארים. פרוטוקולים אלה שימושיים במיוחד עבור מדענים המעוניינים לחקור סחר תוך-תאי ואת הפרשת חלבוני BM ברקמת אפיתל שלמה באמצעות הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. יתר על כן, היכולת לשלב ניתוח רקמת אפיתל עם הכלים הנרחבים של הגנטיקה של Drosophila הופכת את הגישה הזו לחזקה במיוחד. לבסוף, פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לחקר סחר בווסקולרי ומיון של חלבונים אחרים בעלי עניין.
ה-BM חיוני למורפוגנזה עוברית ואיברית, ולתפקודים פיזיולוגיים של מבוגרים. יתר על כן, BM פועל כפלטפורמה איתות לביסוס ותחזוקה של קוטביות אפיתל ומספק לרקמות תמיכה2. עם זאת, המנגנונים המווסתים את המיקום הנכון של חלבוני BM אינם מובנים היטב. הבנה טובה יותר של המסלולים הביולוגיים המוקדשי?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לג’ולי מרקל על הערותיה המועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R15GM137236 ל- O.D. התמונות הקונפוקליות והסופר-רזולוציה נרכשו באמצעות Zeiss LSM 900 עם Airyscan 2, שנרכשה במענק NSF MRI 2018748.
Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |