Summary

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

Published: May 19, 2022
doi:

Summary

קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

Abstract

קרום המרתף (BM) – יריעה מיוחדת של מטריצה חוץ-תאית הקיימת בצד הבסיסי של תאי אפיתל – חיונית לביסוס ותחזוקה של מורפולוגיה של רקמת אפיתל ומורפוגנזה של איברים. יתר על כן, ה- BM חיוני למידול רקמות, משמש כפלטפורמת איתות, ומספק כוחות חיצוניים לעיצוב רקמות ואיברים. למרות התפקידים החשובים הרבים שה-BM ממלא במהלך ההתפתחות התקינה והתנאים הפתולוגיים, המסלולים הביולוגיים השולטים בסחר התוך-תאי של שלפוחיות המכילות BM וכיצד הפרשה בסיסית מובילה לתצהיר מקוטב של חלבוני BM אינם מובנים היטב. האפיתל הזקיק של השחלה דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוינת לחקר התצהיר הבסיסי של חלבוני ממברנת BM, שכן הוא מייצר ומפריש את כל המרכיבים העיקריים של BM. הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה בשילוב עם עיבוד תמונה ברקמות קבועות מאפשרת זיהוי ואפיון של גורמים תאיים המעורבים במיוחד בסחר תוך תאי ובתצהיר של חלבוני BM. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצביעה והדמיה של בועיות המכילות BM ו- BM מופקד באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני באפיתל הזקיקי של שחלת דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לענות על שאלות איכותיות וכמותיות כאחד והוא פותח כדי להתאים לסינון בתפוקה גבוהה, המאפשר זיהוי מהיר ויעיל של גורמים המעורבים בסחר תוך תאי מקוטב ובהפרשה של שלפוחיות במהלך התפתחות רקמת אפיתל.

Introduction

קרום המרתף (BM) הוא יריעה דקה של מטריצה חוץ-תאית דביקה של תאים מרובדים (ECM) הקריטית למבנה אפיתל ולמורפוגנזה1. הוא מכיל כ-50 חלבונים ונמצא בכל מקום ביסוד תאי האפיתל והאנדותל, ומעורר תא שלד, חלק ושריר לב ואדיפוציטים 1,2,3. שלושת המרכיבים העיקריים של ה-BM בצד הבסיסי של תאי האפיתל הם קולגן IV, פרלקן ולמינינים. ה-BM עומד בבסיס תאי האפיתל ואחראי על תפקודים רבים, כולל הפרדת רקמות ומחסום, גדילה ותמיכה, וקיטוב תאים 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . תפקידה כפלטפורמת איתות מווסת את המורפולוגיה וההתמיינות של תאי אפיתל ורקמות במהלך ההתפתחות 3,13,14. יתר על כן, ויסות שגוי של ה- BM ו / או הפרה בשלמותו הם הגורמים העיקריים למצבים פתולוגיים רבים, כולל גרורות גידול 2,15,16. למרות הפונקציות החיוניות המבוצעות על ידי BM במהלך מורפוגנזה של רקמות ואיברים, מרכיבי המסלולים הביולוגיים המוקדשים לסחר תוך-תאי מקוטב ולהפרשה של חלבוני BM ידועים במעורפל.

כדי לחקור את הסחר התוך-תאי של בועיות המכילות BM ואת הפרשת חלבוני BM על ידי תאי אפיתל, האפיתל הזקיקי (FE) של שחלת דרוזופילה הוא מערכת מודל רבת עוצמה (איור 1). שחלת דרוזופילה מורכבת מ-16-20 מבנים ארוכים דמויי צינור, הנקראים אובריולים (איור 1A,B)17,18,19. ניתן לחשוב על כל שחלות כפס ייצור של ביצים, עם התקדמות הגיל של תאי הביצה (שכל אחד מהם מוליד ביצה) שמתחיל בקצה הקדמי ונע לאחור, עד שהביצה הבוגרת יוצאת דרך האובידוקט. כל תא ביצית עטוף על ידי ה-FE, חד-שכבתי של תאי זקיק סומטיים (FCs), המקיף את תאי הנבט המרכזיים (GCs). ה-FE מקוטב מאוד עם קוטביות אפית-בסיסית מובהקת שבה התחום האפיקלי פונה אל הנבט, וחלבוני ה-BM מופרשים באופן בסיסי18,19. ה-FCs מפרישים באופן פעיל את כל המרכיבים העיקריים של ה-BM, כולל קולגן IV, פרלקן ולמינינים 20,21. בתאי אפיתל כגון FCs, רכיבי ה-BM מיוצרים ודורשים מסלול הפרשה מקוטב מיוחד עבור התצהיר שלהם חוץ-תאי. לדוגמה, במקרה של המרכיב הנפוץ ביותר של BM, קולגן IV (Coll IV), הפרטים סביב הסחר וההפרשה התוך-תאיים המקוטבים שלו מעורפלים למרות שהייצור והתצהיר שלו הם המוקד של מחקרים רבים. קול IV מתורגם ברשתית האנדופלסמית (ER), שבה כל פיבריל – המורכב משלושה פוליפפטידים (שתי שרשראות α1 ושרשרת α2 אחת) – מורכב לסליל משולש22. קיפול תקין של Coll IV ותפקוד דורשים מלווים ואנזימים של ER, כולל ליזיל ופרוליל-הידרוקסילאזות כגון Plod ו-PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. אנזימים פוסט-טרנסלציוניים אלה מווסתים את מיון ה-ER של קול IV, שכן האובדן של כל אחד מהם גורם ל-Coll IV להילכד ב-ER הבסיסי 20,23,24,25,26. לאחר מכן, הקולג’ הרביעי המסונתז החדש יוצא מהמיון עבור הגולגי בשלפוחיות מצופות COPII. קולטן המטען Tango1 מסייע באריזת קולגן לתוך שלפוחיות גדולות הקשורות לגולגי שיכולות להכיל חלבונים רב-חומריים גדולים20,27. ברגע ש-Coll IV נארז לתוך שלפוחיות אקסוציטיות תוך-תאיות, הוא מופרש באופן ספציפי באופן בסיסי מתאי אפיתל. כדי לכוון את תצהיר BM לצד הבסיסי, תאי אפיתל דורשים קבוצה נוספת של גורמים המוקדשים במיוחד להפרשת BM מקוטבת. באמצעות ה-FE של שחלת דרוזופילה, אופיינו כמה מרכיבים של התהליך התאי החדש הזה, כולל גורמי חילופי הנוקלאוטידים (GEFs) Crag ו-Stratum, ה-GTPases Rab8 ו-Rab10, כמו גם הרמות של הפוספונינוסיטיד PI(4,5)P2, ו-Kinesin 1 ו-3 חלבונים מוטוריים 20,28,29,30,31 . רכיבים אלה חיוניים להבטחת ההתפלגות המקוטבת של חלבוני BM.

כדי לנטר את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני BM ב-FE, חלבוני קרום מרתף המתויגים באופן אנדוגני (מלכודות חלבון), כגון Viking-GFP (Vkg-GFP או α2 Coll IV-GFP) ו-Perlecan-GFP (Pcan-GFP) יכולים לשמש32,33. הודגם כי קווי מלכודת חלבונים אלה משקפים במדויק את ההתפלגות האנדוגנית של חלבוני BM ומאפשרים זיהוי רגיש יותר של סחרבשלפוחית 28,30. הרכיבים המעורבים בתצהיר המקוטב של BM ב-FE אופיינו לראשונה באמצעות קווי מלכודת חלבונים עבור Vkg-GFP ו-Pcan-GFP 20,28,29,30. ניתן להשתמש במלכודות חלבונים ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטנטים וקווי Gal4 34. יתר על כן, ניתן להשתמש במלכודות חלבונים בשילוב עם צבעים פלואורסצנטיים ו/או חיסון פלואורסצנטי, מה שמאפשר אפיון מדויק של לוקליזציה של חלבוני BM כאשר משווים בין תנאים מסוג בר ומוטנטים35.

כדי להעריך באופן מדויק ויעיל את ההתפלגות והלוקליזציה של שלפוחיות המכילות חלבון BM, מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) וטכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד מהוות יתרון משמעותי לגישות הדמיה אחרות. גישות אלה משלבות הדמיה ברזולוציה גבוהה עם קלות שימוש יחסית. CLSM היא טכניקת מיקרוסקופיה המאפשרת רזולוציה אופטית משופרת על ידי סריקת הדגימה באמצעות לייזר באופן סריקת רסטר באמצעות גלוונומטרים. מפתח הצמצם של חור הפין הוא מרכיב מרכזי במיקרוסקופ קונפוקלי. על-ידי חסימת האותות מחוץ למיקוד המגיעים מעל או מתחת למישור המוקד, מפתח הצמצם של חור הפין מוביל לרזולוציה מעולה ביותר בציר z36. זה גם מאפשר לקבל סדרה של תמונות במישור z, הנקרא z-stack, המתאים לסדרה של קטעים אופטיים. z-stacks יוצרים לאחר מכן תמונה תלת-ממדית של הדגימה, באמצעות שחזור תלת-ממדי, בעזרת תוכנת הדמיה. מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים קונבנציונליים (שדה רחב), בניגוד למיקרוסקופים קונפוקליים, מאפשרים לאור מחוץ למיקוד לתרום לאיכות התמונה, ובכך להקטין את רזולוציית התמונה ואת הניגודיות36,37. זה הופך את מיקרוסקופיית האפיפלואורסצנציה למועמדת פחות אטרקטיבית כאשר חוקרים לוקליזציה של חלבונים או קולוקליזציה.

למרות ש-CLSM היא גישה מתאימה ליישומים שונים, כולל הדמיה ואפיון של הסחר התוך-תאי בחלבוני BM, היא עדיין מהווה בעיה בעת הדמיה של דגימות מתחת לגבול עקיפת האור של Abbe (200-250 ננומטר). בעת הדמיה של דגימות כאלה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, במיוחד בעת שימוש במטרת שמן, יכולה לגרום לרזולוציה גבוהה. עם זאת, טכניקות סופר-רזולוציה עוברות את הגבול של מיקרוסקופיה קונפוקלית. ישנן גישות שונות להשגת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, שלכל אחת מהן מגבלות רזולוציה ספציפיות, וכל אחת מהן מתאימה לניתוחים שונים. גישות אלה כוללות מיקרוסקופיית לוקליזציה פוטואקטיבית (PALM) או מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM) ומיקרוסקופיה אווירית (סופר-רזולוציה) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . למרות של-Airyscan יש רזולוציה גסה יותר מאשר PALM/STORM, STED ו-SIM, הוא עדיין יכול להשיג רזולוציה של עד ~120 ננומטר (בערך פי שניים מהרזולוציה של CLSM). יתר על כן, הודגם כי לגישת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה זו יש יתרון על פני SIM וטכניקות אחרות ברזולוציית-על בעת הדמיית דגימות ודגימות עבות עם יחס אות לרעש נמוך47,48.

Airyscan היא טכנולוגיית מיקרוסקופיה קונפוקלית חדשה יחסית ברזולוציה גבוההיחסית 46. בניגוד ל-CLSMs מסורתיים, המשתמשים ב-pinhole ובגלאי נקודה בודדת כדי לדחות אור מחוץ למיקוד, גישה זו של רזולוציית-על משתמשת בגלאי שטח שפופרת פוטומולטיפלייר (GaAsP) בעל 32 ערוצים של גליום ארסניד פוספיד (GaAsP) שאוסף את כל האור בכל מיקום סריקה45. כל אחד מ-32 הגלאים פועל כחור סיכה קטן, ומקטין את גודל חור הפין מיחידת ה-1.0 Airy Unit המסורתית (A.U.) ל-0.2 A.U. משופרת, מה שמאפשר רזולוציה גבוהה עוד יותר ויחס אות לרעש, תוך שמירה על היעילות של קוטר45 של 1.25 A.U. יתר על כן, הדה-קונבולוציה הליניארית המשמשת את Airyscan גורמת לעלייה של עד פי 2 ברזולוציה45. בהתחשב בכך, CLSM, ובמיוחד מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, מתאימים היטב לחקר חלבוני BM וחלבונים המווסתים את התצהיר הבסיסי של חלבוני BM, מכיוון שהם יכולים לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד למחקרי לוקליזציה וקולוקליזציה, ובכך לספק תובנות חדשות באירועים המרחביים, הזמניים והמולקולריים השולטים בתהליכים אלה.

גישה חלופית למיקרוסקופיה קונפוקלית שניתן להשתמש בה כדי לבצע ניסויי לוקליזציה היא דה-קונבולוציה של תמונות. מאחר שמיקרוסקופיית שדה רחב מאפשרת לאור מחוץ למיקוד להגיע לגלאים, ניתן ליישם אלגוריתמים מתמטיים וחישוביים של דקונבולוציה כדי להסיר או להקצות מחדש אור מחוץ למיקוד מתמונות המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה בשדה רחב, ובכך לשפר את הרזולוציה והניגודיות של התמונה49. ניתן ליישם אלגוריתמים של Deconvolution גם על תמונות קונפוקליות כדי להגדיל עוד יותר את הרזולוציה והניגודיות, ולהפיק תמונות סופיות כמעט דומות לאלה של מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה50. Airyscan עושה שימוש בפירוק מבוסס מסנן ויינר יחד עם הקצאת הפיקסלים מחדש של שפרד, וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש משופרים ביותר. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, נצפתה עלייה של פי 2 ברזולוציה בכל שלושת הממדים המרחביים (120 ננומטר ב-x וב-y, ו-350 ננומטר ב-z) בעת שימוש בטכניקת מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה זו45,51.

כתב יד זה מספק פרוטוקולים מפורטים וממוטבים לצביעה, רכישה והדגמה של סחר ותצהיר תוך-תאיים של חלבוני BM תוך שימוש ב-FE של שחלת דרוזופילה כמערכת מודל בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. קווי דרוזופילה המבטאים חלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, למשל Vkg-GFP ו-Pcan-GFP, הם כלים יעילים ומדויקים להמחשת סחר והפרשת חלבוני BM. בנוסף, ניתן להשתמש בהם בקלות ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטציה וקווי Gal4/UAS 34. למרות שמומלץ להשתמש בחלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, השימוש בנוגדנים נגד חלבוני BM ספציפיים תואם גם את הפרוטוקולים המתוארים. פרוטוקולים אלה שימושיים במיוחד עבור מדענים המעוניינים לחקור סחר תוך-תאי ואת הפרשת חלבוני BM ברקמת אפיתל שלמה באמצעות הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. יתר על כן, היכולת לשלב ניתוח רקמת אפיתל עם הכלים הנרחבים של הגנטיקה של Drosophila הופכת את הגישה הזו לחזקה במיוחד. לבסוף, פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לחקר סחר בווסקולרי ומיון של חלבונים אחרים בעלי עניין.

Protocol

1. הכנת זבובים לניתוחי שחלה שים 10-15 נקבות נקבות דרוזופילה מלנוגסטר (בנות 1-2 ימים) של הגנוטיפ הרצוי בבקבוקון צר המכיל כ-8 מ”ל של מדיום זבוב דרוזופילה מפוזר עם כמות קטנה של שמרי אופה מגורענים 2-3 ימים לפני הנתיחה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. הוספת כמה זכרים לבקבוקון יכולה…

Representative Results

ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי לצלם ולאפיין ביעילות ובדייקנות את הסחר וההפרשה התוך-תאיים של חלבוני BM בתאי אפיתל מקוטבים, כגון FE של שחלת דרוזופילה . לאחר מכן, אנו מספקים תוצאות צפויות שהושגו באמצעות השיטות המתוארות, כמו גם עצות מועילות ומלכודות פוטנציאליות. כדי לעשות זאת, Vkg-GFP, Vkg מ…

Discussion

ה-BM חיוני למורפוגנזה עוברית ואיברית, ולתפקודים פיזיולוגיים של מבוגרים. יתר על כן, BM פועל כפלטפורמה איתות לביסוס ותחזוקה של קוטביות אפיתל ומספק לרקמות תמיכה2. עם זאת, המנגנונים המווסתים את המיקום הנכון של חלבוני BM אינם מובנים היטב. הבנה טובה יותר של המסלולים הביולוגיים המוקדשי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לג’ולי מרקל על הערותיה המועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R15GM137236 ל- O.D. התמונות הקונפוקליות והסופר-רזולוציה נרכשו באמצעות Zeiss LSM 900 עם Airyscan 2, שנרכשה במענק NSF MRI 2018748.

Materials

Alexa Fluor 546 phalloidin Invitrogen A22283 F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin Invitrogen A22287 F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody abcam ab30637 For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount Polysciences, Inc. 1860620 Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast) Genesee Scientific 62-103 To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution) Sigma-Aldrich A7284 For blocking solution
Depression wells Electron Microscopy Sciences 7156101 For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle Fisher scientifc 13-820-024
Drosophila Incubator Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) Bloomington Drosophila Stock Center 33594 RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5) Fine Science Tools 11251-30 For dissection
Glass Concavity Slide Electron Microscopy Sciences 7187804 For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 Invitrogen A11036 Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342) Invitrogen H3570 DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes Kimtech Fisher Scientific: 06-666 Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC Leica For ovary imaging
Microscope Slides Corning 294875X25 Microscope Slides
Nutating platform rocker Corning Life Sciences 6720 For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF Genesee Scientific 66-121 Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific: 15713 For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher scientific BP2944100 For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant Invitrogen P36980 Mounting Medium
Square Cover Glass Corning 285022 Cover glass for microscope slides
Triton x-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 Zeiss Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope Zeiss Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) Zeiss Image acquisition and processing

References

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Play Video

Cite This Article
Shah, H. P., Devergne, O. Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis. J. Vis. Exp. (183), e63778, doi:10.3791/63778 (2022).

View Video