Конфокальная визуализация и визуализация сверхвысокого разрешения поляризованного внутриклеточного трафика и секреции белков базальной мембраны во время оогенеза дрозофилы

Базальная мембрана (BM) представляет собой тонкий лист слоистого клеточного адгезивного внеклеточного матрикса (ECM), критического для эпителиальной структуры и морфогенеза¹. Он содержит ~ 50 белков и находится повсеместно лежащим в основе эпителиальных и эндотелиальных клеток, а также обволакивает скелетные, гладкие и сердечные мышечные клетки и адипоциты ^1,2,3. Тремя основными компонентами БМ на базальной стороне эпителиальных клеток являются коллаген IV, перлекан и ламинины. BM лежит в основе эпителиальных клеток и отвечает за многие функции, включая разделение тканей и барьер, рост и поддержку, а также поляризацию клеток 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Его роль в качестве сигнальной платформы регулирует морфологию и дифференцировку эпителиальных клеток и тканей во время развития ^3,13,14. Более того, неправильная регуляция БМ и/или нарушение его целостности являются основными причинами многих патологических состояний, включая метастазирование опухоли ^2,15,16. Несмотря на существенные функции, выполняемые БМ во время морфогенеза тканей и органов, компоненты биологического пути (путей), предназначенные для поляризованного внутриклеточного трафика и секреции белков БМ, смутно известны.

Для изучения внутриклеточного трафика BM-содержащих везикул и секреции белков BM эпителиальными клетками фолликулярный эпителий (FE) яичника Drosophila является мощной модельной системой (рисунок 1). Яичник дрозофилы содержит 16-20 длинных трубчатых структур, называемых явариолами (рисунок 1A,B)17,18,19. Каждый овариол можно рассматривать как линию сборки яиц с возрастной прогрессией яйцеклеток (каждая из которых дает начало яйцеклетке), которая начинается на переднем конце и движется кзади, пока зрелая яйцеклетка не выйдет через яйцевод. Каждая яйцеклеточная камера инкапсулирована FE, монослоем клеток соматических фолликулов (FC), который окружает клетки центральной зародышевой линии (GC). FE сильно поляризован с отчетливой апикально-базальной полярностью, где апикальный домен обращен к зародышевой линии, а белки BM секретируются базально^18,19. ФК активно секретируют все основные компоненты БМ, включая коллаген IV, перлекан и ламины^20,21. В эпителиальных клетках, таких как FC, компоненты BM вырабатываются и требуют специализированного поляризованного пути секреции для их внеклеточного осаждения. Например, в случае наиболее распространенного компонента БМ, коллагена IV (Coll IV), детали, окружающие его поляризованный внутриклеточный трафик и секрецию, расплывчаты, несмотря на то, что его производство и осаждение находятся в центре внимания многих исследований. Coll IV транслируется в эндоплазматический ретикулум (ER), где каждая фибриля, состоящая из трех полипептидов (две цепи α1 и одна цепь α2), собирается в тройную спираль²². Правильное складывание и функционирование Coll IV требуют ER-шаперонов и ферментов, включая лизил и пролил-гидроксилазы, такие как Plod и PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Эти посттрансляционные ферменты регулируют сортировку ER Coll IV, так как потеря каждого из них приводит к тому, что Coll IV попадает в ловушку в базальном ER 20,23,24,25,26. Затем вновь синтезированный Coll IV выходит из ER для Гольджи в везикулах, покрытых COPII. Грузовой рецептор Tango1 помогает упаковывать коллагены в значительные везикулы, связанные с Гольджи, которые могут вмещать большие многомерные белки^20,27. Как только Coll IV упаковывается во внутриклеточные экзоцитарные везикулы, он специфически секретируется базально из эпителиальных клеток. Чтобы направить отложение БМ на базальную сторону, эпителиальным клеткам требуется другой набор факторов, специально предназначенных для поляризованной секреции БМ. Используя FE яичника Drosophila, были охарактеризованы несколько компонентов этого нового клеточного процесса, включая нуклеотидные обменные факторы (GEFs) Crag and Stratum, GTPasEs Rab8 и Rab10, а также уровни фосфоинозитида PI(4,5)P2 и моторных белков Kinesin 1 и 3 20,28,29,30,31 . Эти компоненты имеют решающее значение для обеспечения поляризованного распределения белков BM.

Для мониторинга внутриклеточной локализации белков BM в FE могут^{быть использованы} эндогенно меченые белки базальной мембраны (белковые ловушки), такие как Viking-GFP (Vkg-GFP или α2 Coll IV-GFP) и Perlecan-GFP (Pcan-GFP). Было показано, что эти линии белковой ловушки точно отражают эндогенное распределение белков BM и позволяют более чувствительно обнаруживать везикулярный трафик^28,30. Компоненты, участвующие в поляризованном осаждении БМ в FE, были впервые охарактеризованы с использованием линий белковых ловушек для Vkg-GFP и Pcan-GFP ^20,28,29,30. Белковые ловушки могут быть использованы в различных генетических фонах, включая мутантов и линии Gal4 ³⁴. Кроме того, белковые ловушки могут быть использованы в комбинации с флуоресцентными красителями и/или флуоресцентным иммуноокрашиванием, что позволяет точно охарактеризовать локализацию белков BM при сравнении условий дикого типа и мутантов³⁵.

Для точной и эффективной оценки распределения и локализации везикул, содержащих белки BM, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) и методы визуализации со сверхвысоким разрешением представляют собой значительное преимущество перед другими подходами к визуализации. Эти подходы сочетают изображения с высоким разрешением с относительной простотой использования. CLSM – это метод микроскопии, который позволяет улучшить оптическое разрешение путем сканирования образца лазером в растровом сканировании с использованием гальванометров. Отверстие с точечным отверстием является основным компонентом конфокального микроскопа. Блокируя нефокусированные сигналы, поступающие сверху или ниже фокальной плоскости, апертура с точечным отверстием приводит к значительному превосходному разрешению по оси^{Z 36}. Это также позволяет получить серию изображений в z-плоскости, называемую z-стеком, соответствующую ряду оптических сечений. z-стеки впоследствии создают 3D-изображение образца с помощью 3D-реконструкции с помощью программного обеспечения для визуализации. Обычные эпифлуоресцентные (широкоугольные) микроскопы, в отличие от конфокальных микроскопов, позволяют расфокусированному свету способствовать качеству изображения, снижению разрешения изображения и контрастности^36,37. Это делает эпифлуоресцентную микроскопию менее привлекательным кандидатом при изучении локализации белка или колокализации.

Хотя CLSM является подходящим подходом для различных применений, включая визуализацию и характеристику внутриклеточного трафика белков BM, он по-прежнему представляет проблему при визуализации образцов ниже дифракционного предела света Аббе (200-250 нм). При визуализации таких образцов конфокальная микроскопия, особенно при использовании масляного объектива, может привести к высокому разрешению. Однако методы сверхвысокого разрешения превышают предел конфокальной микроскопии. Существуют различные подходы к достижению микроскопии со сверхвысоким разрешением, каждый из которых имеет определенные пределы разрешения, и каждый подходит для различных анализов. Эти подходы включают фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM) или стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию (STORM), микроскопию с стимулированным эмиссионным истощением (STED), структурированную микроскопию освещения (SIM) и микроскопию Airyscan (сверхразрешение) ^{38,39,40,41,42,43,44,45,46} . Хотя Airyscan имеет более грубое разрешение, чем PALM / STORM, STED и SIM, он все же может достигать разрешения до ~ 120 нм (примерно в два раза больше разрешения CLSM). Кроме того, было показано, что этот подход к микроскопии со сверхвысоким разрешением имеет преимущество перед SIM и другими методами сверхвысокого разрешения при визуализации толстых образцов и образцов с низким отношением сигнал/шум^47,48.

Airyscan является относительно новой технологией конфокальной микроскопии сверхвысокального разрешения⁴⁶. В отличие от традиционных CLSM, которые используют точечные и одноточечные детекторы для отклонения нефокусированного света, этот подход со сверхвысоким разрешением использует 32-канальный детектор площади фотоумножителя арсенида галлия (GaAsP), который собирает весь свет в каждой позиции сканирования⁴⁵. Каждый из 32 детекторов работает как небольшое точечное отверстие, уменьшая размер точечного отверстия с традиционного 1.0 Airy Unit (A.U.) до улучшенного 0.2 A.U., обеспечивая еще более высокое разрешение и отношение сигнал/шум, сохраняя при этом эффективность диаметра 1,25 A.U.⁴⁵. Кроме того, линейная деконволюция, используемая Airyscan, приводит к увеличению разрешения⁴⁵ в 2 раза. Принимая это во внимание, CLSM и, в частности, микроскопия со сверхвысоким разрешением хорошо подходят для изучения белков BM и белков, которые регулируют базальное осаждение белков BM, поскольку они могут производить изображения с очень высоким разрешением для исследований локализации и колокализации, тем самым обеспечивая новое понимание пространственных, временных и молекулярных событий, которые контролируют эти процессы.

Альтернативным подходом к конфокальной микроскопии, который может быть использован для проведения экспериментов по локализации, является деконволюция изображений. Поскольку широкоугольная микроскопия позволяет нефокусированному свету достигать детекторов, математические и вычислительные алгоритмы деконволюции могут быть применены для удаления или переназначения нефокусированного света из изображений, полученных с помощью широкоугольной микроскопии, тем самым улучшая разрешение и контрастность изображения⁴⁹. Алгоритмы деконволюции также могут быть применены к конфокальным изображениям для дальнейшего увеличения разрешения и контрастности, создавая конечные изображения, почти сопоставимые с микроскопией сверхвысокого разрешения⁵⁰. Airyscan использует деконволюцию на основе фильтра Вайнера вместе с переназначением пикселей Шеппарда, что приводит к значительно улучшенному пространственному разрешению и соотношению сигнал/шум. По сравнению с конфокальной микроскопией, увеличение разрешения в 2 раза во всех трех пространственных измерениях (120 нм в x и y и 350 нм в z) наблюдается при использовании этого метода микроскопии со сверхвысоким разрешением^45,51.

Эта рукопись содержит подробные и оптимизированные протоколы для окрашивания, получения и визуализации внутриклеточного трафика и осаждения белков BM с использованием FE яичника Drosophila в качестве модельной системы в сочетании с конфокальной микроскопией и микроскопией сверхвысокального разрешения. Линии дрозофилы , экспрессирующие эндогенно меченые белки базальной мембраны, например, Vkg-GFP и Pcan-GFP, являются эффективными и точными инструментами для визуализации трафика и секреции белка BM. Кроме того, они могут быть легко использованы в различных генетических фонах, включая мутантные и Gal4/UAS линии³⁴. Хотя рекомендуются эндогенно помеченные белки базальной мембраны, использование антител против специфических белков BM также совместимо с описанными протоколами. Эти протоколы особенно полезны для ученых, которые заинтересованы в изучении внутриклеточного трафика и секреции белков BM в интактной эпителиальной ткани с использованием конфокальной визуализации и визуализации сверхвысокого разрешения. Более того, способность сочетать анализ эпителиальной ткани с обширными инструментами генетики дрозофилы делает этот подход особенно мощным. Наконец, эти протоколы могут быть легко адаптированы для изучения везикулярного трафика и сортировки других белков, представляющих интерес.