Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

La membrana basale (BM) è un sottile foglio di matrice extracellulare aderente alle cellule stratificate (ECM) fondamentale per la struttura epiteliale e la morfogenesi¹. Comprende ~ 50 proteine e si trova ubiquitariamente alla base delle cellule epiteliali ed endoteliali e delle cellule del muscolo scheletrico, liscio e cardiaco e degli adipociti ^1,2,3. I tre componenti principali del BM sul lato basale delle cellule epiteliali sono Collagen IV, Perlecan e Laminine. Il BM è alla base delle cellule epiteliali ed è responsabile di molte funzioni, tra cui la separazione e la barriera dei tessuti, la crescita e il supporto e la polarizzazione cellulare ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Il suo ruolo di piattaforma di segnalazione regola la morfologia e la differenziazione delle cellule epiteliali e dei tessuti durante lo sviluppo ^3,13,14. Inoltre, l’errata regolazione del BM e/o una violazione della sua integrità sono le cause primarie di molte condizioni patologiche, tra cui le metastasi tumorali ^2,15,16. Nonostante le funzioni essenziali svolte dal BM durante la morfogenesi tissutale e d’organo, i componenti delle vie biologiche dedicate al traffico intracellulare polarizzato e alla secrezione di proteine BM sono vagamente note.

Per studiare il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e la secrezione di proteine BM da parte delle cellule epiteliali, l’epitelio follicolare (FE) dell’ovaio Drosophila è un potente sistema modello (Figura 1). Un’ovaia di Drosophila comprende 16-20 strutture lunghe simili a tubi, chiamate ovarioli (Figura 1A,B)17,18,19. Ogni ovariole può essere pensato come una catena di montaggio dell’uovo, con la progressione dell’età delle camere dell’uovo (che danno origine a ciascuna un uovo) che inizia all’estremità anteriore e si muove posteriormente, fino a quando l’uovo maturo esce attraverso l’ovidotto. Ogni camera uovo è incapsulata dal FE, un monostrato di cellule follicolari somatiche (FC), che circonda le cellule germinali centrali (GC). Il FE è altamente polarizzato con una distinta polarità apicale-basale in cui il dominio apicale è rivolto verso la linea germinale e le proteine BM sono secrete basalmente^18,19. I FC secernono attivamente tutti i principali componenti del BM, tra cui Collagen IV, Perlecan e Laminins ^20,21. Nelle cellule epiteliali come le FC, i componenti BM sono prodotti e richiedono una via di secrezione polarizzata specializzata per la loro deposizione extracellulare. Ad esempio, nel caso del componente più abbondante del BM, collagene IV (Coll IV), i dettagli che circondano il suo traffico intracellulare polarizzato e la secrezione sono vaghi nonostante la sua produzione e deposizione siano al centro di molti studi. Coll IV è tradotto nel reticolo endoplasmatico (ER), che è anche dove ogni fibrilla – composta da tre polipeptidi (due catene α1 e una catena α2) – è assemblata in una tripla elica²². Il corretto ripiegamento e funzione di Coll IV richiedono chaperoni ed enzimi ER, tra cui lisil e prolil-idrossilasi come Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Questi enzimi post-traduzionali regolano lo smistamento ER di Coll IV, poiché la perdita di ciascuno fa sì che Coll IV sia intrappolato nell’ER basale 20,23,24,25,26. Quindi, il Coll IV appena sintetizzato esce dal pronto soccorso per il Golgi in vescicole rivestite copiose. Il recettore di carico Tango1 aiuta a confezionare i collageni in vescicole legate al Golgi di grandi dimensioni che possono ospitare grandi proteine multimeriche^20,27. Una volta che Coll IV è confezionato in vescicole esocitiche intracellulari, viene specificamente secreto basalmente dalle cellule epiteliali. Per dirigere la deposizione di BM sul lato basale, le cellule epiteliali richiedono un altro insieme di fattori specificamente dedicati alla secrezione di BM polarizzata. Utilizzando il FE dell’ovaio Drosophila, sono stati caratterizzati alcuni componenti di questo nuovo processo cellulare, tra cui i fattori di scambio nucleotidico (GEF) Crag e Stratum, le GTPasi Rab8 e Rab10, nonché i livelli del fosfoinositide PI(4,5)P2 e le proteine motorie Kinesin 1 e 3 20,28,29,30,31 . Questi componenti sono fondamentali per garantire la distribuzione polarizzata delle proteine BM.

Per monitorare la localizzazione intracellulare delle proteine BM nella FE, possono essere utilizzate proteine di membrana basale endogenamente marcate (trappole proteiche), come Viking-GFP (Vkg-GFP o α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP)^32,33. Queste linee di trappola proteica hanno dimostrato di riflettere accuratamente la distribuzione endogena delle proteine BM e consentono un rilevamento più sensibile del traffico vescicolare^28,30. I componenti coinvolti nella deposizione polarizzata di BM nel FE sono stati inizialmente caratterizzati utilizzando linee di trappola proteica per Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Le trappole proteiche possono essere utilizzate in diversi background genetici, compresi i mutanti e le linee Gal4 ³⁴. Inoltre, le trappole proteiche possono essere utilizzate in combinazione con coloranti fluorescenti e/o immunocolorazione a fluorescenza, consentendo una caratterizzazione precisa della localizzazione delle proteine BM quando si confrontano le condizioni wild-type e mutanti³⁵.

Per valutare in modo accurato ed efficiente la distribuzione e la localizzazione delle vescicole contenenti proteine BM, la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e le tecniche di imaging a super-risoluzione presentano un vantaggio significativo rispetto ad altri approcci di imaging. Questi approcci accoppiano l’imaging ad alta risoluzione con una relativa facilità d’uso. CLSM è una tecnica di microscopia che consente una migliore risoluzione ottica scansionando il campione con un laser in modo raster utilizzando galvanometri. L’apertura stenopeica è un componente fondamentale di un microscopio confocale. Bloccando i segnali fuori fuoco provenienti da sopra o sotto il piano focale, l’apertura stenopeica si traduce in una risoluzione altamente superiore nell’asse z³⁶. Ciò consente anche di ottenere una serie di immagini nel piano z, chiamato z-stack, corrispondente a una serie di sezioni ottiche. Z-stacks crea successivamente un’immagine 3D del campione, tramite ricostruzione 3D, con l’ausilio di software di imaging. I microscopi a epifluorescenza (widefield) convenzionali, a differenza dei microscopi confocali, consentono alla luce sfocata di contribuire alla qualità dell’immagine, diminuendo la risoluzione dell’immagine e il contrasto^36,37. Ciò rende la microscopia a epifluorescenza un candidato meno attraente quando si studia la localizzazione o la colocalizzazione delle proteine.

Sebbene CLSM sia un approccio adatto per varie applicazioni, tra cui l’imaging e la caratterizzazione del traffico intracellulare di proteine BM, presenta ancora un problema quando si visualizzano campioni al di sotto del limite di diffrazione della luce di Abbe (200-250 nm). Quando si esegue l’imaging di tali campioni, la microscopia confocale, specialmente quando si utilizza un obiettivo ad olio, può portare ad un’alta risoluzione. Tuttavia, le tecniche di super-risoluzione superano il limite della microscopia confocale. Esistono vari approcci per ottenere la microscopia a super-risoluzione, ognuno con limiti di risoluzione specifici e ciascuno appropriato per analisi diverse. Questi approcci includono microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM) o microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM), microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e microscopia Airyscan (super-risoluzione) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Sebbene Airyscan abbia una risoluzione più grossolana di PALM / STORM, STED e SIM, può comunque raggiungere una risoluzione fino a ~ 120 nm (circa il doppio della risoluzione di CLSM). Inoltre, questo approccio di microscopia a super-risoluzione ha dimostrato di avere un vantaggio rispetto alla SIM e ad altre tecniche di super-risoluzione quando si visualizzano campioni spessi e campioni con un basso rapporto segnale-rumore^47,48.

Airyscan è una tecnologia di microscopia confocale a super-risoluzione relativamente nuova⁴⁶. A differenza dei CLSM tradizionali, che utilizzano i rilevatori stenopeici e a punto singolo per respingere la luce fuori fuoco, questo approccio a super-risoluzione utilizza un rilevatore di area del tubo fotomoltiplicatore a 32 canali di fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP) che raccoglie tutta la luce in ogni posizione di scansione⁴⁵. Ciascuno dei 32 rivelatori funziona come un piccolo foro stenopeico, riducendo le dimensioni del foro stenopeico dalla tradizionale 1.0 Airy Unit (A.U.) a una maggiore 0.2 A.U., consentendo una risoluzione e un rapporto segnale-rumore ancora più elevati, pur mantenendo l’efficienza di un diametro 1.25 A.U.⁴⁵. Inoltre, la deconvoluzione lineare utilizzata da Airyscan si traduce in un aumento fino a 2 volte della risoluzione⁴⁵. Tenendo conto di ciò, i CLSM, e in particolare la microscopia a super-risoluzione, sono adatti per studiare le proteine BM e le proteine che regolano la deposizione basale delle proteine BM, in quanto possono produrre immagini ad altissima risoluzione per studi di localizzazione e colocalizzazione, fornendo così nuove intuizioni sugli eventi spaziali, temporali e molecolari che controllano questi processi.

Un approccio alternativo alla microscopia confocale che può essere utilizzato per eseguire esperimenti di localizzazione è la deconvoluzione delle immagini. Poiché la microscopia a largo campo consente alla luce fuori fuoco di raggiungere i rivelatori, è possibile applicare algoritmi di deconvoluzione matematica e computazionale per rimuovere o riassegnare la luce fuori fuoco dalle immagini ottenute con la microscopia a campo largo, migliorando così la risoluzione e il contrasto dell’immagine⁴⁹. Gli algoritmi di deconvoluzione possono essere applicati anche alle immagini confocali per aumentare ulteriormente la risoluzione e il contrasto, producendo immagini finali quasi paragonabili a quelle della microscopia a super-risoluzione⁵⁰. Airyscan utilizza la deconvoluzione basata sul filtro Weiner insieme alla riassegnazione dei pixel di Sheppard, con conseguente miglioramento della risoluzione spaziale e del rapporto segnale-rumore. Rispetto alla microscopia confocale, si osserva un aumento di 2 volte della risoluzione in tutte e tre le dimensioni spaziali (120 nm in x e y e 350 nm in z) quando si utilizza questa tecnica di microscopia a super-risoluzione ^45,51.

Questo manoscritto fornisce protocolli dettagliati e ottimizzati per macchiare, acquisire e visualizzare il traffico intracellulare e la deposizione di proteine BM utilizzando il FE dell’ovaio Drosophila come sistema modello accoppiato con microscopia confocale e super-risoluzione. Le linee di Drosophila che esprimono proteine di membrana basale endogenamente etichettate, ad esempio Vkg-GFP e Pcan-GFP, sono strumenti efficienti e accurati per visualizzare il traffico e la secrezione di proteine BM. Inoltre, possono essere facilmente utilizzati in diversi background genetici, tra cui mutanti e Gal4 / UAS linee³⁴. Sebbene si raccomandino proteine di membrana basale marcate endogenamente, l’uso di anticorpi contro specifiche proteine BM è anche compatibile con i protocolli descritti. Questi protocolli sono particolarmente utili per gli scienziati interessati a studiare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nel tessuto epiteliale intatto utilizzando l’imaging confocale e super-risoluzione. Inoltre, la capacità di combinare l’analisi del tessuto epiteliale con gli strumenti espansivi della genetica Drosophila rende questo approccio particolarmente potente. Infine, questi protocolli potrebbero essere facilmente adattati per studiare il traffico vescicolare e lo smistamento di altre proteine di interesse.