التصوير البؤري وفائق الدقة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي أثناء تكوين بويضات ذبابة الفاكهة

الغشاء السفلي (BM) هو ورقة رقيقة من مصفوفة خارج الخلية ملتصقة بالخلايا (ECM) ذات طبقات ضرورية للبنية الظهارية والتشكل¹. وهو يتألف من ~ 50 بروتينا ويوجد في كل مكان وراء الخلايا الظهارية والبطانية ، ويغلف خلايا العضلات الهيكلية والملساء والقلبية والخلايا الشحمية¹،^2،3. المكونات الرئيسية الثلاثة ل BM في الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية هي الكولاجين الرابع والبيرليكان واللامينين. BM يكمن وراء الخلايا الظهارية وهو مسؤول عن العديد من الوظائف ، بما في ذلك فصل الأنسجة وحاجزها ، والنمو والدعم ، واستقطاب الخلايا²،³،⁴،⁵،⁶،⁷،^8،9،10،^11،12 . دورها كمنصة إشارات ينظم مورفولوجيا وتمايز الخلايا والأنسجة الظهارية أثناء التطور³،^13،14. علاوة على ذلك ، فإن سوء تنظيم BM و / أو خرق سلامته هما السببان الرئيسيان للعديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك ورم خبيث^{ورم 2}،^15،16. على الرغم من الوظائف الأساسية التي يؤديها BM أثناء تكوين الأنسجة والأعضاء ، فإن مكونات المسار (المسارات) البيولوجية المخصصة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM معروفة بشكل غامض.

لدراسة الاتجار داخل الخلايا للحويصلات المحتوية على BM وإفراز بروتينات BM بواسطة الخلايا الظهارية ، فإن الظهارة الجريبية (FE) لمبيض ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجي قوي (الشكل 1). يتكون مبيض ذبابة الفاكهة من 16-20 بنية طويلة تشبه الأنبوب ، تسمى المبيضات (الشكل 1A ، B) ¹⁷،^18،19. يمكن اعتبار كل مبيض خط تجميع البيض ، مع التقدم العمري لغرف البيض (التي تؤدي كل منها إلى بويضة) التي تبدأ في الطرف الأمامي وتتحرك خلفيا ، حتى تخرج البويضة الناضجة عبر قناة البيض. يتم تغليف كل غرفة بويضة بواسطة FE ، وهي طبقة أحادية من خلايا الجريب الجسدية (FCs) ، التي تحيط بخلايا الخط الجرثومي المركزي (GCs). FE مستقطب للغاية مع قطبية قطبية قطبية قاعية مميزة حيث يواجه المجال القمي الخط الجرثومي ، ويتم إفراز بروتينات BM بشكل أساسي^18,19. تفرز FCs بنشاط جميع المكونات الرئيسية ل BM ، بما في ذلك الكولاجين الرابع والبيرليكان و Laminins^20,21. في الخلايا الظهارية مثل FCs ، يتم إنتاج مكونات BM وتتطلب مسار إفراز مستقطب متخصص لترسيبها خارج الخلايا. على سبيل المثال ، في حالة المكون الأكثر وفرة في BM ، الكولاجين IV (Coll IV) ، فإن التفاصيل المحيطة بالاتجار والإفراز المستقطبين داخل الخلايا غامضة على الرغم من أن إنتاجه وترسيبه هما محور العديد من الدراسات. يتم ترجمة Coll IV في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، والتي يتم فيها أيضا تجميع كل ليف – يتكون من ثلاثة ببتيدات متعددة (سلسلتان α1 وسلسلة α2 واحدة) – في حلزون ثلاثي²². يتطلب الطي السليم ل Coll IV ووظيفته مرافقات وإنزيمات ER ، بما في ذلك lysyl و prolyl-hydroxylases مثل Plod و PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. تنظم هذه الإنزيمات ما بعد الانتقالية فرز ER ل Coll IV ، حيث يؤدي فقدان كل منها إلى محاصرة Coll IV في ER القاعدي^{20,23,24,25,26}. بعد ذلك ، يخرج Coll IV المركب حديثا من ER ل Golgi في الحويصلات المغلفة ب COPII. يساعد مستقبل الشحن Tango1 في تعبئة الكولاجين في حويصلات كبيرة مرتبطة ب Golgi يمكنها استيعاب بروتينات كبيرة متعددة الوسائط^20,27. بمجرد تعبئة Coll IV في حويصلات خارجية داخل الخلايا ، يتم إفرازه بشكل أساسي من الخلايا الظهارية. لتوجيه ترسب BM إلى الجانب القاعدي ، تتطلب الخلايا الظهارية مجموعة أخرى من العوامل المخصصة خصيصا لإفراز BM المستقطب. باستخدام FE من مبيض ذبابة الفاكهة ، تم توصيف بعض مكونات هذه العملية الخلوية الجديدة ، بما في ذلك عوامل تبادل النيوكليوتيدات (GEFs) Crag و Stratum ، و GTPases Rab8 و Rab10 ، بالإضافة إلى مستويات phosphoinositide PI (4,5) P2 ، و Kinesin 1 و 3 البروتينات الحركية 20,28,29,30,31 . هذه المكونات حاسمة في ضمان التوزيع المستقطب لبروتينات BM.

لمراقبة التوطين داخل الخلايا لبروتينات BM في FE ، يمكن استخدام بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا (مصائد البروتين) ، مثل Viking-GFP (Vkg-GFP أو α2 Coll IV-GFP) و Perlecan-GFP (Pcan-GFP)^32,33. وقد ثبت أن خطوط فخ البروتين هذه تعكس بدقة التوزيع الداخلي لبروتينات BM وتسمح باكتشاف أكثر حساسية للاتجار الحويصلي^28,30. تم تمييز المكونات المشاركة في الترسيب المستقطب ل BM في FE لأول مرة باستخدام خطوط مصيدة البروتين ل Vkg-GFP و Pcan-GFP 20,28,29,30. يمكن استخدام مصائد البروتين في خلفيات جينية مختلفة ، بما في ذلك الطفرات وخطوط Gal4 34. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مصائد البروتين مع أصباغ الفلورسنت و / أو تلطيخ المناعة الفلورية ، مما يسمح بتوصيف دقيق لتوطين بروتينات BM عند مقارنة النوع البري والظروف الطافرة³⁵.

لتقييم توزيع وتوطين الحويصلات المحتوية على بروتين BM بدقة وكفاءة، يقدم الفحص المجهري للمسح بالليزر البؤري (CLSM) وتقنيات التصوير فائقة الدقة ميزة كبيرة لأساليب التصوير الأخرى. تجمع هذه الأساليب بين التصوير عالي الدقة وسهولة الاستخدام النسبية. CLSM هي تقنية الفحص المجهري التي تسمح بتحسين الدقة البصرية عن طريق مسح العينة بالليزر بطريقة المسح النقطي باستخدام الجلفانومترات. فتحة الثقب هي مكون أساسي في المجهر البؤري. من خلال حجب الإشارات خارج التركيز البؤري القادمة من أعلى أو أسفل المستوى البؤري، ينتج عن فتحة الثقب دقة فائقة للغاية في المحور z³⁶. هذا يجعل من الممكن أيضا الحصول على سلسلة من الصور في المستوى z ، تسمى z-stack ، المقابلة لسلسلة من الأقسام البصرية. تقوم مكدسات z لاحقا بإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد للعينة ، عبر إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد ، بمساعدة برنامج التصوير. تسمح المجاهر التقليدية الفائقة التألق (واسعة المجال) ، على عكس المجاهر البؤرية ، للضوء خارج التركيز البؤري بالمساهمة في جودة الصورة ، مما يقلل من دقة الصورة والتباين^36,37. وهذا يجعل المجهر الفائق التألق مرشحا أقل جاذبية عند دراسة توطين البروتين أو التوطين المشترك.

على الرغم من أن CLSM هو نهج مناسب لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك التصوير وتوصيف الاتجار داخل الخلايا من بروتينات BM ، إلا أنه لا يزال يمثل مشكلة عند تصوير عينات أقل من حد حيود آبي للضوء (200-250 نانومتر). عند تصوير مثل هذه العينات ، يمكن أن يؤدي الفحص المجهري البؤري ، خاصة عند استخدام هدف نفطي ، إلى دقة عالية. ومع ذلك ، فإن تقنيات الدقة الفائقة تتجاوز حد الفحص المجهري البؤري. هناك العديد من الأساليب لتحقيق الفحص المجهري فائق الدقة ، لكل منها حدود دقة محددة ، وكل منها مناسب للتحليلات المختلفة. وتشمل هذه النهج مجهر التوطين المنشط ضوئيا (PALM) أو المجهر البصري العشوائي لإعادة البناء (STORM) ، والفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، ومجهر الإضاءة الهيكلية (SIM) ، ومجهر Airyscan (فائق الدقة)³⁸،³⁹،40،41،42،⁴³،⁴⁴،^45،46 . على الرغم من أن Airyscan لديه دقة أكثر خشونة من PALM / STORM ، STED ، و SIM ، إلا أنه لا يزال بإمكانه تحقيق دقة تصل إلى ~ 120 نانومتر (حوالي ضعف دقة CLSM). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن نهج الفحص المجهري فائق الدقة هذا يتمتع بميزة على بطاقة SIM وغيرها من التقنيات فائقة الدقة عند تصوير عينات سميكة وعينات ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة^47,48.

Airyscan هي تقنية مجهرية بؤرية فائقة الدقة جديدة نسبيا⁴⁶. على عكس CLSMs التقليدية ، التي تستخدم كاشفات الثقب والنقطة الواحدة لرفض الضوء خارج التركيز البؤري ، يستخدم هذا النهج فائق الدقة كاشف منطقة أنبوب المضاعف الضوئي لأنبوب الزرنيخيد الغاليوم (GaAsP) المكون من 32 قناة والذي يجمع كل الضوء في كل موضع مسح^{ضوئي 45}. يعمل كل جهاز من أجهزة الكشف ال 32 كثقب صغير ، مما يقلل من حجم الثقب من وحدة 1.0 Airy Unit التقليدية (A.U.) إلى 0.2 A.U. المحسنة ، مما يتيح دقة أعلى ونسبة إشارة إلى ضوضاء ، مع الحفاظ على كفاءة قطر 1.25 A.U.⁴⁵. علاوة على ذلك ، فإن فك الالتفاف الخطي المستخدم من قبل Airyscan يؤدي إلى زيادة تصل إلى 2x في الدقة⁴⁵. مع أخذ ذلك في الاعتبار ، فإن CLSM ، وتحديدا الفحص المجهري فائق الدقة ، مناسب تماما لدراسة بروتينات BM والبروتينات التي تنظم الترسيب القاعدي لبروتينات BM ، حيث يمكنها إنتاج صور عالية الدقة للغاية لدراسات التوطين والتوطين المشترك ، وبالتالي توفير رؤى جديدة في الأحداث المكانية والزمانية والجزيئية التي تتحكم في هذه العمليات.

هناك نهج بديل للفحص المجهري البؤري الذي يمكن استخدامه لإجراء تجارب التوطين وهو إزالة التفاف الصورة. نظرا لأن الفحص المجهري واسع المجال يسمح للضوء خارج نطاق التركيز البؤري بالوصول إلى أجهزة الكشف ، يمكن تطبيق خوارزميات إزالة الالتفاف الرياضية والحسابية لإزالة أو إعادة تعيين الضوء خارج التركيز البؤري من الصور التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري واسع المجال ، وبالتالي تحسين دقة وتباين الصورة⁴⁹. يمكن أيضا تطبيق خوارزميات فك الالتفاف على الصور متحدة البؤرة لزيادة الدقة والتباين ، مما ينتج صورا نهائية مماثلة تقريبا لتلك الموجودة في المجهر فائق الدقة⁵⁰. تستفيد Airyscan من إزالة الالتفاف القائمة على مرشح Weiner إلى جانب إعادة تعيين بكسل Sheppard ، مما يؤدي إلى دقة مكانية محسنة للغاية ونسبة إشارة إلى ضوضاء. بالمقارنة مع المجهر البؤري ، لوحظت زيادة قدرها 2x في الدقة في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة (120 نانومتر في x و y ، و 350 نانومتر في z) عند استخدام تقنية الفحص المجهري فائقة الدقة^45,51.

توفر هذه المخطوطة بروتوكولات مفصلة ومحسنة لتلطيخ واكتساب وتصور الاتجار داخل الخلايا وترسب بروتينات BM باستخدام FE لمبيض ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي إلى جانب الفحص المجهري البؤري وفائق الدقة. خطوط ذبابة الفاكهة التي تعبر عن بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا ، على سبيل المثال ، Vkg-GFP و Pcan-GFP ، هي أدوات فعالة ودقيقة لتصور الاتجار ببروتين BM وإفرازه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامها بسهولة في خلفيات جينية مختلفة ، بما في ذلك الخطوط المتحورة و Gal4 / UAS 34. على الرغم من التوصية باستخدام بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا ، إلا أن استخدام الأجسام المضادة ضد بروتينات BM محددة متوافق أيضا مع البروتوكولات الموصوفة. هذه البروتوكولات مفيدة بشكل خاص للعلماء المهتمين بدراسة الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM في الأنسجة الظهارية السليمة باستخدام التصوير البؤري وفائق الدقة. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على الجمع بين تحليل الأنسجة الظهارية والأدوات الواسعة لعلم الوراثة ذبابة الفاكهة تجعل هذا النهج قويا بشكل خاص. وأخيرا، يمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لدراسة الاتجار بالحويصلات وفرز البروتينات الأخرى ذات الأهمية.