Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Het keldermembraan (BM) is een dunne plaat van gelaagde cel-adherente extracellulaire matrix (ECM) die cruciaal is voor de epithelstructuur en morfogenese¹. Het bestaat uit ~ 50 eiwitten en wordt alomtegenwoordig aangetroffen onder de epitheel- en endotheelcellen, en verwarmt skelet-, gladde en hartspiercellen en adipocyten ^1,2,3. De drie belangrijkste componenten van de BM aan de basale kant van de epitheelcellen zijn Collageen IV, Perlecan en Lamininen. De BM ligt ten grondslag aan de epitheelcellen en is verantwoordelijk voor vele functies, waaronder weefselscheiding en -barrière, groei en ondersteuning, en celpolarisatie ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Zijn rol als signaleringsplatform reguleert de morfologie en differentiatie van epitheelcellen en weefsels tijdens de ontwikkeling ^3,13,14. Bovendien zijn de verkeerde regulatie van de BM en /of een schending van de integriteit ervan de primaire oorzaken van veel pathologische aandoeningen, waaronder tumormetastase ^2,15,16. Ondanks de essentiële functies die de BM uitvoert tijdens weefsel- en orgaanmorfogenese, zijn de componenten van de biologische route (s) gewijd aan de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten vaag bekend.

Om de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes en de secretie van BM-eiwitten door epitheelcellen te bestuderen, is het folliculaire epitheel (FE) van de Drosophila-eierstok een krachtig modelsysteem (figuur 1). Een Drosophila-eierstok bestaat uit 16-20 lange, buisachtige structuren, ovarioles genaamd (figuur 1A, B)17,18,19. Elke ovariole kan worden gezien als een eierassemblagelijn, met de leeftijdsprogressie van eikamers (die elk aanleiding geven tot een ei) die begint aan het voorste uiteinde en achterste beweegt, totdat het rijpe ei door de eileider naar buiten komt. Elke eikamer wordt ingekapseld door de FE, een monolaag van somatische follikelcellen (FCs), die de centrale kiembaancellen (GC’s) omringt. De FE is sterk gepolariseerd met een duidelijke apicale-basale polariteit waarbij het apicale domein naar de kiembaan is gericht en de BM-eiwitten basaal worden uitgescheiden^18,19. De VC’s scheiden actief alle belangrijke componenten van de BM af, waaronder Collagen IV, Perlecan en Laminins^20,21. In epitheelcellen zoals FCs worden de BM-componenten geproduceerd en vereisen ze een gespecialiseerde gepolariseerde secretieroute voor hun afzetting extracellulair. Bijvoorbeeld, in het geval van de meest voorkomende component van de BM, Collageen IV (Coll IV), zijn de details rond de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie vaag, ondanks dat de productie en afzetting de focus is van veel studies. Coll IV wordt vertaald in het endoplasmatisch reticulum (ER), waar ook elk fibril – samengesteld uit drie polypeptiden (twee α1-ketens en één α2-keten) – wordt geassembleerd tot een drievoudige helix²². Een goede Coll IV-vouwing en -functie vereisen ER-chaperonnes en enzymen, waaronder lysyl- en prolyl-hydroxylasen zoals Plod en PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Deze posttranslationele enzymen reguleren de ER-sortering van Coll IV, omdat het verlies van elk ervoor zorgt dat Coll IV gevangen zit in de basale ER 20,23,24,25,26. Vervolgens verlaat nieuw gesynthetiseerde Coll IV de ER voor de Golgi in COPII-gecoate blaasjes. De ladingreceptor Tango1 helpt bij het verpakken van collageen in aanzienlijke Golgi-gebonden blaasjes die plaats bieden aan grote multimere eiwitten^20,27. Zodra Coll IV is verpakt in intracellulaire exocytaire blaasjes, wordt het specifiek basaal uitgescheiden uit epitheelcellen. Om BM-afzetting naar de basale kant te leiden, hebben epitheelcellen een andere reeks factoren nodig die specifiek zijn gewijd aan gepolariseerde BM-secretie. Met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok zijn enkele componenten van dit nieuwe cellulaire proces gekarakteriseerd, waaronder de nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF’s) Crag en Stratum, de GTPases Rab8 en Rab10, evenals de niveaus van de fosfoinositide PI (4,5) P2 en Kinesine 1 en 3 motoreiwitten 20,28,29,30,31 . Deze componenten zijn van cruciaal belang voor de gepolariseerde verdeling van BM-eiwitten.

Om de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwitten in de FE te monitoren, kunnen endogene gelabelde keldermembraaneiwitten (eiwitvallen), zoals Viking-GFP (Vkg-GFP of α2 Coll IV-GFP) en Perlecan-GFP (Pcan-GFP) worden gebruikt ^32,33. Van deze eiwitvallijnen is aangetoond dat ze de endogene verdeling van BM-eiwitten nauwkeurig weergeven en een gevoeligere detectie van vesiculaire handel mogelijk maken^28,30. De componenten die betrokken zijn bij de gepolariseerde afzetting van BM in de FE werden voor het eerst gekarakteriseerd met behulp van eiwitvallijnen voor Vkg-GFP en Pcan-GFP ^20,28,29,30. Eiwitvallen kunnen worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutanten en Gal4-lijnen ³⁴. Bovendien kunnen eiwitvallen worden gebruikt in combinatie met fluorescerende kleurstoffen en/of fluorescentie-immunostaining, waardoor een nauwkeurige karakterisering van de lokalisatie van BM-eiwitten mogelijk is bij het vergelijken van wildtype en mutante condities³⁵.

Om de distributie en lokalisatie van BM-eiwitbevattende blaasjes nauwkeurig en efficiënt te beoordelen, vormen confocale laserscanmicroscopie (CLSM) en beeldvormingstechnieken met superresolutie een aanzienlijk voordeel voor andere beeldvormingsbenaderingen. Deze benaderingen koppelen beeldvorming met hoge resolutie aan relatief gebruiksgemak. CLSM is een microscopietechniek die een verbeterde optische resolutie mogelijk maakt door het monster met een laser te scannen op een rasterscanmanier met behulp van galvanometers. De opening van het gaatje is een kerncomponent van een confocale microscoop. Door de onscherpe signalen van boven of onder het brandpuntsvlak te blokkeren, resulteert het gaatje diafragma in een zeer superieure resolutie in de z-as³⁶. Dit maakt het ook mogelijk om een reeks afbeeldingen in het z-vlak te verkrijgen, een z-stack genaamd, die overeenkomen met een reeks optische secties. z-stacks maken vervolgens een 3D-beeld van het specimen, via 3D-reconstructie, met behulp van beeldbewerkingssoftware. Conventionele epifluorescentie (widefield) microscopen, in tegenstelling tot confocale microscopen, zorgen ervoor dat onscherp licht bijdraagt aan de beeldkwaliteit, waardoor de beeldresolutie en het contrast^{met 36,37} afnemen. Dit maakt epifluorescentiemicroscopie een minder aantrekkelijke kandidaat bij het bestuderen van eiwitlokalisatie of colocalisatie.

Hoewel CLSM een geschikte aanpak is voor verschillende toepassingen, waaronder beeldvorming en karakterisering van de intracellulaire handel in BM-eiwitten, vormt het nog steeds een probleem bij het afbeelden van monsters onder de diffractielimiet van Abbe van licht (200-250 nm). Bij het afbeelden van dergelijke monsters kan confocale microscopie, vooral bij gebruik van een olieobjectief, resulteren in een hoge resolutie. Superresolutietechnieken overschrijden echter de limiet van confocale microscopie. Er zijn verschillende benaderingen om superresolutiemicroscopie te bereiken, elk met specifieke resolutielimieten en elk geschikt voor verschillende analyses. Deze benaderingen omvatten foto-geïnactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) of stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED), gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en Airyscan (superresolutie) microscopie 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Hoewel Airyscan een grovere resolutie heeft dan PALM / STORM, STED en SIM, kan het nog steeds een resolutie van maximaal ~ 120 nm bereiken (ongeveer twee keer de resolutie van CLSM). Bovendien is aangetoond dat deze superresolutiemicroscopiebenadering een voordeel heeft ten opzichte van SIM- en andere superresolutietechnieken bij het afbeelden van dikke monsters en monsters met een lage signaal-ruisverhouding^{van 47,48}.

Airyscan is een relatief nieuwe superresolutie confocale microscopietechnologie⁴⁶. In tegenstelling tot traditionele CLSM’s, die de pinhole- en single point-detectors gebruiken om onscherp licht af te stoten, maakt deze superresolutiebenadering gebruik van een 32-kanaals galliumarsenidefosfide (GaAsP) fotomultiplicatorbuisgebieddetector die al het licht verzamelt op elke scanpositie⁴⁵. Elk van de 32 detectoren werkt als een klein gaatje, waardoor de pinhole-grootte wordt verkleind van de traditionele 1.0 Airy Unit (A.U.) tot een verbeterde 0.2 A.U., waardoor een nog hogere resolutie en signaal-ruisverhouding mogelijk is, met behoud van de efficiëntie van een 1.25 A.U. diameter⁴⁵. Bovendien resulteert de lineaire deconvolutie die Airyscan gebruikt in een tot 2x hogere resolutie⁴⁵. Dit in aanmerking nemend, zijn CLSM, en specifiek superresolutiemicroscopie, zeer geschikt om BM-eiwitten en eiwitten te bestuderen die de basale afzetting van BM-eiwitten reguleren, omdat ze afbeeldingen met een zeer hoge resolutie kunnen produceren voor lokalisatie- en colokalisatiestudies, waardoor nieuwe inzichten worden verkregen in de ruimtelijke, temporele en moleculaire gebeurtenissen die deze processen beheersen.

Een alternatieve benadering van confocale microscopie die kan worden gebruikt om lokalisatie-experimenten uit te voeren, is beelddeconvolutie. Aangezien widefield-microscopie het mogelijk maakt om onscherp licht de detectoren te bereiken, kunnen wiskundige en computationele deconvolutie-algoritmen worden toegepast om onscherp licht uit beelden verkregen door widefield-microscopie te verwijderen of opnieuw toe te wijzen, waardoor de resolutie en het contrast van het beeld worden verbeterd⁴⁹. Deconvolutie-algoritmen kunnen ook worden toegepast op confocale beelden om de resolutie en het contrast verder te verhogen, waardoor uiteindelijke beelden worden geproduceerd die bijna vergelijkbaar zijn met die van superresolutiemicroscopie⁵⁰. Airyscan maakt gebruik van Weiner filter-gebaseerde deconvolutie samen met Sheppard’s pixel hertoewijzing, wat resulteert in een sterk verbeterde ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding. Vergeleken met confocale microscopie wordt een toename van 2x in resolutie in alle drie de ruimtelijke dimensies (120 nm in x en y en 350 nm in z) waargenomen bij gebruik van deze superresolutiemicroscopietechniek^45,51.

Dit manuscript biedt gedetailleerde en geoptimaliseerde protocollen om de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten te kleuren, te verwerven en te visualiseren met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok als een modelsysteem in combinatie met confocale en superresolutiemicroscopie. Drosophila-lijnen die endogene gelabelde keldermembraaneiwitten tot expressie brengen, bijvoorbeeld Vkg-GFP en Pcan-GFP, zijn efficiënte en nauwkeurige hulpmiddelen om BM-eiwithandel en -secretie te visualiseren. Bovendien kunnen ze gemakkelijk worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutant en Gal4 / UAS-lijnen ³⁴. Hoewel endogeen gelabelde keldermembraaneiwitten worden aanbevolen, is het gebruik van antilichamen tegen specifieke BM-eiwitten ook compatibel met de beschreven protocollen. Deze protocollen zijn vooral nuttig voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van intracellulaire handel en de secretie van BM-eiwitten in intact epitheelweefsel met behulp van confocale en superresolutie beeldvorming. Bovendien maakt de mogelijkheid om epitheliale weefselanalyse te combineren met de uitgebreide hulpmiddelen van Drosophila genetica deze aanpak bijzonder krachtig. Ten slotte kunnen deze protocollen eenvoudig worden aangepast om de vesiculaire handel en het sorteren van andere interessante eiwitten te bestuderen.