El presente protocolo describe el estudio de las interacciones neutrófilos-biofilm. Las biopelículas de Staphylococcus aureus se establecen in vitro y se incuban con neutrófilos humanos derivados de sangre periférica. La respuesta de explosión oxidativa de los neutrófilos se cuantifica, y la localización de neutrófilos dentro de la biopelícula se determina mediante microscopía.
Los neutrófilos son la primera línea de defensa desplegada por el sistema inmune durante la infección microbiana. In vivo, los neutrófilos son reclutados al sitio de la infección donde utilizan procesos como la fagocitosis, la producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS, RNS, respectivamente), NETosis (trampa extracelular de neutrófilos) y la desgranulación para matar microbios y resolver la infección. Las interacciones entre neutrófilos y microbios planctónicos han sido ampliamente estudiadas. Ha habido intereses emergentes en el estudio de las infecciones causadas por biopelículas en los últimos años. Las biopelículas exhiben propiedades, incluida la tolerancia a la muerte por neutrófilos, distintas de sus contrapartes cultivadas planctónicamente. Con el establecimiento exitoso de modelos de biopelículas in vitro e in vivo , ahora se pueden investigar las interacciones entre estas comunidades microbianas con diferentes células inmunes. Aquí, las técnicas que utilizan una combinación de modelos tradicionales de biopelícula y ensayos de actividad de neutrófilos bien establecidos se adaptan específicamente para estudiar las interacciones de neutrófilos y biopelículas. La microscopía de fluorescencia de campo amplio se utiliza para monitorear la localización de neutrófilos en biopelículas. Estas biopelículas se cultivan en condiciones estáticas, seguidas de la adición de neutrófilos derivados de la sangre periférica humana. Las muestras se tiñen con tintes apropiados antes de la visualización bajo el microscopio. Además, la producción de ROS, que es una de las muchas respuestas de neutrófilos contra patógenos, se cuantifica en presencia de una biopelícula. La adición de células inmunes a este sistema establecido ampliará la comprensión de las interacciones huésped-patógeno al tiempo que garantiza el uso de condiciones estandarizadas y optimizadas para medir estos procesos con precisión.
Una biopelícula es una comunidad de microbios asociados a la superficie o agregados no unidos encerrados en una sustancia polimérica extracelular (EPS)1,2. Estas comunidades protegen los microorganismos encerrados de los factores estresantes ambientales, incluida la tolerancia a los agentes antimicrobianos y al sistema inmunológico3. Varias especies microbianas patógenas forman biofilms que han sido asociados con infecciones crónicas4. El desarrollo de biopelículas es un proceso intrincado que implica la fijación a superficies, la producción de EPS, la proliferación celular, la estructuración de biopelículas y el desprendimiento celular5. Una vez que las células se dispersan para formar una biopelícula, permanecen planctónicas o se translocan a un nuevo sustrato y reinician el desarrollo de la biopelícula6.
Staphylococcus aureus, un patógeno oportunista, sigue un esquema general de desarrollo de biopelículas, incluyendo adhesión, proliferación, maduración y dispersión7. El proceso de unión en biopelículas de S. aureus está dictado por interacciones hidrofóbicas, ácidos teicoicos y componentes de superficie microbiana que reconocen moléculas de matriz adhesiva (MSCRAMMs)8,9. A medida que comienza la proliferación de S. aureus, se produce EPS, que consiste principalmente en polisacáridos, proteínas, ADN extracelular y ácidos teicoicos5. A medida que se producen componentes EPS, también se producen varias exoenzimas y moléculas pequeñas, lo que contribuye a la estructura 3-dimensional de la biopelícula y ayuda en el desprendimiento5. S. aureus aprovecha este estilo de vida altamente coordinado para establecer diversas infecciones crónicas, incluyendo infecciones debidas a la permanencia de dispositivos médicos10.
El S. aureus resistente a la meticilina (SARM) es una de las principales causas de infecciones relacionadas con dispositivos médicos permanentes, como catéteres venosos y urinarios centrales, articulaciones protésicas, marcapasos, válvulas cardíacas mecánicas y dispositivos intrauterinos11. Durante tales infecciones, los neutrófilos son las primeras células inmunes del huésped reclutadas en el sitio de la infección para combatir los patógenos a través de múltiples estrategias12. Estos incluyen fagocitosis, desgranulación, producción reactiva de especies de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) o liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) para eliminar patógenos13.
La generación de ROS tras la fagocitosis de microbios es una de las respuestas antimicrobianas clave exhibidas por los neutrófilos14. La fagocitosis aumenta si los microbios están recubiertos de opsoninas, particularmente inmunoglobulinas y componentes del complemento que se encuentran en el suero15. Los microbios opsonizados son reconocidos por los receptores de la superficie celular en los neutrófilos y engullidos, formando un compartimento llamado fagosoma15. Los neutrófilos generan y liberan ROS en el fagosoma a través de la NADPH-oxidasa16 asociada a la membrana. Este complejo enzimático multicomponente genera aniones superóxido mediante la transferencia de electrones al oxígeno molecular16. Además, los neutrófilos también generan RNS a través de la expresión de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS)17. Estos radicales con alto superóxido y óxido nítrico dentro del fagosoma tienen amplias actividades antimicrobianas. Pueden interactuar con centros metálicos en enzimas y dañar ácidos nucleicos, proteínas y membranas celulares del patógeno 18,19,20,21. Numerosos microbios adoptan un estilo de vida de biopelícula y emplean diferentes estrategias para evadir la muerte por ROS22,23. Por lo tanto, los ensayos estandarizados que acoplan biopelículas con neutrófilos para cuantificar ROS son beneficiosos para obtener resultados consistentes.
Mientras que los ensayos, como la cuantificación de la producción de ROS de neutrófilos, proporcionan información sobre las respuestas de los neutrófilos a las biopelículas, la capacidad de visualizar las interacciones de los neutrófilos dentro de una biopelícula también puede servir como una herramienta poderosa. El uso de colorantes fluorescentes para microscopía a menudo requiere optimización para obtener imágenes de alta calidad que se pueden utilizar para el análisis de imágenes de microscopía. La flexibilidad para optimizar algunas condiciones es limitada, ya que los neutrófilos pueden sufrir la muerte celular después del aislamiento. Además, las biopelículas generalmente se lavan para eliminar la población planctónica de la configuración experimental antes de la adición de neutrófilos. Durante el lavado, la variabilidad entre las biopelículas replicadas puede surgir debido a la pérdida de biomasa parcial si las biopelículas se adhieren libremente a la superficie.
En términos generales, los métodos actuales en el campo para analizar las interacciones entre neutrófilos y biopelículas incluyen principalmente microscopía, citometría de flujo y enumeración de unidades formadoras de colonias (UFC)24,25,26,27. La microscopía implica el uso de colorantes que tiñen directamente los neutrófilos y las biopelículas, o se dirigen a diversas respuestas de neutrófilos contra microbios como la formación de NET, la desgranulación y la muerte celular25,28. Un subconjunto de estas respuestas, como la muerte celular de neutrófilos y la desgranulación, también puede analizarse mediante citometría de flujo, pero requiere que los neutrófilos no se asocien preferentemente con grandes agregados de microbios en una biopelícula28,29. La citometría de flujo también puede cuantificar algunos parámetros del biofilm, como la viabilidad celular27. Estos procesos, sin embargo, requieren la interrupción de la biomasa de biofilm y no serían útiles para visualizar otras interacciones importantes como la distribución espacial de los neutrófilos y sus componentes dentro de un biofilm27,29,30.
El presente protocolo se centra en adaptar algunos de los métodos utilizados tradicionalmente para estudiar las interacciones neutrófilos-biofilm en biofilms que han sido optimizados para proporcionar una variabilidad mínima durante la manipulación. Por lo tanto, este protocolo proporciona métodos estandarizados para cultivar y cuantificar biopelículas, aislar neutrófilos humanos primarios de sangre periférica, cuantificar la producción de ROS y visualizar las interacciones biopelícula-neutrófilos a través de microscopía. Este protocolo se puede adaptar a diferentes sistemas para comprender las interacciones biopelícula-neutrófilos teniendo en cuenta la heterogeneidad entre los grupos de donantes.
Ha habido numerosos esfuerzos para cultivar biofilms robustos y reproducibles de S. aureus para experimentos posteriores in vitro48,49,50. Se describe un protocolo estandarizado que aprovecha la naturaleza catiónica de PLL, así como la suplementación de los medios con glucosa para el crecimiento de biopelículas robustas in vitro de S. aureus. La adición de PLL permite una mejor unión de la célula bacteriana cargada negativamente a las superficies recubiertas de PLL cargadas positivamente. Es importante tener en cuenta que la PLL a una concentración de 10 μg/ml tiene actividad antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y S. aureus cuando se incuba durante 24 h51. La misma concentración se utiliza para recubrir superficies; sin embargo, el exceso de PLL se aspira, lo que hace que la concentración de PLL sea inferior a 10 μg / ml cuando se siembra para el crecimiento de biopelículas.
Es importante señalar que la PLL ha funcionado solo en medios de crecimiento específicos como MEMα con glucosa al 2%, donde se observó que S. aureus produjo biofilms robustos con una variabilidad mínima (Figura 2A). La concentración de PLL que se utilizará junto con otros tipos de medios requeriría una mayor optimización, como el uso de una mayor concentración de PLL para recubrir los pozos. Además, estas condiciones se han optimizado para una biopelícula monoespecie de S. aureus. Si bien las biopelículas de heridas crónicas son a menudo polimicrobianas, la estandarización de ensayos para estudiar la biopelícula monoespecie y sus interacciones con neutrófilos y otras células inmunes es clave para comprender su contribución a la patogénesis52. Estos protocolos estandarizados se pueden optimizar aún más para mantener y estudiar biopelículas polimicrobianas y sus interacciones con los neutrófilos.
También se observó que los medios de cultivo bacterianos ricos, como la TSB, condujeron a una pérdida de viabilidad de neutrófilos (Figura 1). Por lo tanto, se optimizaron las condiciones de crecimiento de las biopelículas de S. aureus en MEMα, utilizadas para cultivos celulares de mamíferos. Para estudios con neutrófilos, este medio apoya la viabilidad de los neutrófilos y promueve el crecimiento de S. aureus. Si bien se observó que los medios afectan la viabilidad de los neutrófilos, también es importante considerar que los neutrófilos aislados de sangre humana periférica sufren apoptosis ex vivo con aproximadamente un 70% de neutrófilos apoptóticos a las 20 h53. Esto requiere un manejo adecuado, como almacenar los neutrófilos en hielo cuando se prepara para los experimentos, usar reactivos libres de endotoxinas y prevenir la activación de neutrófilos evitando el vórtice de muestras con neutrófilos.
La evaluación del estallido oxidativo en neutrófilos se realiza rutinariamente para determinar el efecto destructor de los neutrófilos sobre el patógeno14,54,55. Estos estudios se realizan con frecuencia con bacterias planctónicas donde se agregan neutrófilos, y la respuesta de explosión oxidativa se cuantifica utilizando quimioluminiscencia amplificada por luminol que detecta aniones superóxido producidos por neutrófilos. El presente protocolo se modifica reemplazando las bacterias planctónicas con biopelícula de S. aureus de 18 h cultivada estáticamente. Como tal, los neutrófilos se pueden agregar directamente a la biopelícula para evaluar su activación. Por otro lado, las bacterias en las biopelículas producen enzimas, como la catalasa y la superóxido dismutasa para desintoxicar ROS 23,56. Las biopelículas de Staphylococcus epidermidis producen una catalasa más alta que su contraparte planctónica bajo estrés57. La quimioluminiscencia total de los neutrófilos estimulados por PMA en una biopelícula de S. aureus es significativamente menor que la de los neutrófilos estimulados por PMA donde la biopelícula está ausente (Figura 2). Esto puede deberse a la actividad de estas enzimas desintoxicantes. Además, las biopelículas de S. aureus producen varias toxinas formadoras de poros llamadas leucocidinas que matan a los neutrófilos58. La respuesta reducida al estallido también es probable que se deba a la viabilidad reducida de los neutrófilos en presencia de biopelícula de S. aureus. Si bien este estudio utiliza luminol que detecta las ROS totales producidas tanto dentro como fuera de las células, otros reactivos, como CM-H 2 DCFDA (5-(y-6)-clorometil-2’7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato) o isoluminol, deben considerarse si el objetivo del trabajo es estudiar específicamente la producción de ROS intracelular o extracelular14,53,54.
La capacidad de visualizar las interacciones neutrófilos-biopelícula a través de la microscopía puede ser informativa sobre el comportamiento de los neutrófilos y las biopelículas en presencia mutua. Los espectros de excitación y emisión de los colorantes fluorescentes y proteínas representan una instantánea de la interacción entre una biopelícula de S. aureus de 18 h y neutrófilos después de una incubación de 30 minutos. Para capturar eficazmente las señales de las células teñidas, es importante limitar la exposición de las muestras a fuentes de luz mientras se configuran las muestras para microscopía. Durante la obtención de imágenes, se evitó el fotoblanqueo rápido de las muestras al reducir la intensidad de la fuente de luz al ajustar todos los parámetros, como la altura de la pila Z y el tiempo de exposición para diferentes canales.
Estas prácticas simples permitieron obtener imágenes de microscopía adecuadas donde se observó que pocos neutrófilos se localizan dentro de la biopelícula (Figura 4A). Esto puede deberse a los espacios presentes dentro del biofilm ya que el biofilm de 18 h de S. aureus cultivado en MEMα con 2% de glucosa no cubre uniformemente la superficie (Figura 4B). Sin embargo, el uso de medios ricos en otros estudios ha demostrado un césped uniforme de crecimiento de biopelícula de S. aureus y leucocitos que penetran a través de la biopelícula30,58. Además, también se observa que hubo muerte celular de neutrófilos después de 30 min de incubación con biofilms de S. aureus debido a leucocidinas producidas por biofilm de S. aureus que lisan neutrófilos58 (Figura 4A, D). La adición de un paso de lavado para eliminar los neutrófilos no adheridos después de incubarlos con biofilm durante 30 minutos eliminó ~ 15% de los neutrófilos muertos del sistema en comparación con el grupo sin lavar, en el que la microscopía se realizó inmediatamente después de 30 minutos de incubación (Figura 4D). También se observaron neutrófilos interactuando con S. aureus (Figura 4C). Se requieren experimentos adicionales para evaluar si S. aureus es engullido por neutrófilos o unido a la superficie celular de los neutrófilos54. La obtención de imágenes de neutrófilos y biopelículas es el primer paso para evaluar varias funcionalidades de neutrófilos aguas abajo, como la fagocitosis y la NETosis54,59. El efecto de los neutrófilos sobre las biopelículas también se puede evaluar cuantificando la biomasa de la biopelícula, los cambios estructurales de la biopelícula y la viabilidad de la biopelícula, entre muchos otros, utilizando las herramientas de análisis de imágenes enumeradas en el paso 5.6. Por último, existe variabilidad de donante a donante en los neutrófilos; Por lo tanto, se recomienda que se utilicen al menos tres donantes diferentes para estudios con neutrófilos.
En general, los ensayos in vitro estandarizados se combinaron para evaluar las interacciones entre los neutrófilos y las biopelículas. Aunque estos ensayos utilizan S. aureus, los protocolos descritos pueden adaptarse fácilmente para estudiar otros patógenos. Si bien existen varios modelos in vivo para estudiar las interacciones huésped-patógeno, pueden ser costosos y laboriosos, especialmente si las condiciones no están optimizadas. Trabajar con ensayos in vitro estandarizados permite optimizar las condiciones experimentales y confirmar las observaciones antes de pasar a un sistema in vivo. Finalmente, se han utilizado varios modelos de infección animal para estudiar las interacciones biopelícula-neutrófilos in vivo. Sin embargo, es importante considerar las diferencias inmunológicas entre los modelos humanos y animales60,61,62,63. Esto requiere el uso de neutrófilos derivados de humanos para estudiar estas complejas interacciones huésped-patógeno.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (R01AI077628) a DJW y un Premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón (19CDA34630005) a ESG. Agradecemos al Dr. Paul Stoodley por proporcionarnos la cepa USA 300 LAC GFP. Además, reconocemos los recursos del Centro de Microscopía e Imágenes del Campus (CMIF) y el Recurso Compartido de Microscopía (MSR) del Centro Integral del Cáncer de OSU (OSUCCC), la Universidad Estatal de Ohio. También agradecemos a Amelia Staats, Peter Burback y Lisa Coleman del laboratorio Stoodley por realizar extracciones de sangre.
0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
Band-aids | Used for blood draw | ||
BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
Hemacytometer | Bright Line | ||
Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
Luminol | Sigma | A8511-5G | |
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Turnicate | Used for blood draw | ||
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |