Il presente protocollo descrive lo studio delle interazioni neutrofili-biofilm. I biofilm di Staphylococcus aureus sono stabiliti in vitro e incubati con neutrofili umani derivati dal sangue periferico. La risposta di scoppio ossidativo dei neutrofili viene quantificata e la localizzazione dei neutrofili all’interno del biofilm viene determinata al microscopio.
I neutrofili sono la prima linea di difesa dispiegata dal sistema immunitario durante l’infezione microbica. In vivo, i neutrofili vengono reclutati nel sito di infezione dove utilizzano processi come la fagocitosi, la produzione di specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto (ROS, RNS, rispettivamente), la NETosi (trappola extracellulare dei neutrofili) e la degranulazione per uccidere i microbi e risolvere l’infezione. Le interazioni tra neutrofili e microbi planctonici sono state ampiamente studiate. Negli ultimi anni sono emersi interessi nello studio delle infezioni causate dai biofilm. I biofilm mostrano proprietà, tra cui la tolleranza all’uccisione da parte dei neutrofili, distinte dalle loro controparti coltivate in planctonico. Con il successo della creazione di modelli di biofilm sia in vitro che in vivo , le interazioni tra queste comunità microbiche con diverse cellule immunitarie possono ora essere studiate. Qui, le tecniche che utilizzano una combinazione di modelli di biofilm tradizionali e saggi di attività dei neutrofili ben consolidati sono adattate specificamente per studiare le interazioni tra neutrofili e biofilm. La microscopia a fluorescenza ad ampio campo viene utilizzata per monitorare la localizzazione dei neutrofili nei biofilm. Questi biofilm sono coltivati in condizioni statiche, seguiti dall’aggiunta di neutrofili derivati dal sangue periferico umano. I campioni vengono colorati con coloranti appropriati prima della visualizzazione al microscopio. Inoltre, la produzione di ROS, che è una delle tante risposte dei neutrofili contro i patogeni, è quantificata in presenza di un biofilm. L’aggiunta di cellule immunitarie a questo sistema consolidato amplierà la comprensione delle interazioni ospite-patogeno, garantendo al contempo l’uso di condizioni standardizzate e ottimizzate per misurare accuratamente questi processi.
Un biofilm è una comunità di microbi associati alla superficie o aggregati non attaccati racchiusi in una sostanza polimerica extracellulare (EPS)1,2. Queste comunità proteggono i microrganismi racchiusi dai fattori di stress ambientali, compresa la tolleranza agli agenti antimicrobici e al sistema immunitario3. Diverse specie microbiche patogene formano biofilm che sono stati associati a infezioni croniche4. Lo sviluppo di biofilm è un processo complesso che coinvolge l’attaccamento alle superfici, la produzione di EPS, la proliferazione cellulare, la strutturazione del biofilm e il distacco cellulare5. Una volta che le cellule si disperdono per formare un biofilm, rimangono planctoniche o traslocano in un nuovo substrato e riavviano lo sviluppo del biofilm6.
Lo Staphylococcus aureus, un patogeno opportunista, segue uno schema generale di sviluppo del biofilm, tra cui attaccamento, proliferazione, maturazione e dispersione7. Il processo di attaccamento nei biofilm di S. aureus è dettato da interazioni idrofobiche, acidi teicoici e componenti superficiali microbici che riconoscono le molecole della matrice adesiva (MSCRAMM)8,9. All’inizio della proliferazione di S. aureus,viene prodotto EPS, che consiste principalmente di polisaccaridi, proteine, DNA extracellulare e acidi teicoici, 5. Man mano che vengono prodotti componenti EPS, vengono prodotti anche vari esoenzimi e piccole molecole, contribuendo alla struttura 3-dimensionale del biofilm e favorendo il distacco5. S. aureus sfrutta questo stile di vita altamente coordinato per stabilire varie infezioni croniche, comprese le infezioni dovute alla presenza di dispositivi medici10.
Lo S. aureus meticillino-resistente (MRSA) è una delle principali cause di infezioni correlate ai dispositivi medici permanenti, come cateteri venosi e urinari centrali, articolazioni protesiche, pacemaker, valvole cardiache meccaniche e dispositivi intrauterini11. Durante tali infezioni, i neutrofili sono le prime cellule immunitarie ospiti reclutate nel sito di infezione per combattere i patogeni attraverso strategie multiple12. Questi includono la fagocitosi, la degranulazione, la produzione di specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto (ROS / RNS) o il rilascio di trappole extracellulari (NET) per eliminare i patogeni13.
La generazione di ROS dopo fagocitosi dei microbi è una delle risposte antimicrobiche chiave esibite dai neutrofili14. La fagocitosi è potenziata se i microbi sono rivestiti in opsonine, in particolare immunoglobuline e componenti del complemento presenti nel siero15. I microbi opsonizzati vengono quindi riconosciuti dai recettori della superficie cellulare sui neutrofili e inghiottiti, formando un compartimento chiamato fagosoma15. I neutrofili generano e rilasciano ROS nel fagosoma attraverso la NADPH-ossidasi16 associata alla membrana. Questo complesso enzimatico multicomponente genera anioni superossido trasferendo elettroni all’ossigeno molecolare16. Inoltre, i neutrofili generano anche RNS attraverso l’espressione di ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS)17. Questi radicali ad alto superossido e ossido nitrico all’interno del fagosoma hanno ampie attività antimicrobiche. Possono interagire con i centri metallici negli enzimi e danneggiare gli acidi nucleici, le proteine e le membrane cellulari del patogeno 18,19,20,21. Numerosi microbi adottano uno stile di vita biofilm e impiegano diverse strategie per eludere l’uccisione da ROS22,23. Pertanto, saggi standardizzati che accoppiano biofilm con neutrofili per quantificare i ROS sono utili per risultati coerenti.
Mentre i saggi, come la quantificazione della produzione di ROS neutrofili, forniscono informazioni sulle risposte dei neutrofili ai biofilm, la capacità di visualizzare le interazioni dei neutrofili all’interno di un biofilm può anche servire come un potente strumento. L’uso di coloranti fluorescenti per la microscopia richiede spesso l’ottimizzazione per ottenere immagini di alta qualità che possono essere utilizzate per l’analisi di imaging al microscopio. La flessibilità di ottimizzare alcune condizioni è limitata in quanto i neutrofili possono subire la morte cellulare post-isolamento. Inoltre, i biofilm vengono tipicamente lavati per rimuovere la popolazione planctonica dal set-up sperimentale prima dell’aggiunta di neutrofili. Durante il lavaggio, la variabilità tra i biofilm replicati può verificarsi a causa della perdita di biomassa parziale se i biofilm sono debolmente aderenti alla superficie.
In generale, i metodi attuali nel campo per analizzare le interazioni tra neutrofili e biofilm includono principalmente microscopia, citometria a flusso e enumerazione delle unità formanti colonie (CFU)24,25,26,27. La microscopia prevede l’uso di coloranti che colorano direttamente i neutrofili e i biofilm o colpiscono varie risposte dei neutrofili contro microbi come la formazione di NET, la degranulazione e la morte cellulare25,28. Un sottoinsieme di queste risposte, come la morte e la degranulazione delle cellule neutrofile, può anche essere analizzato tramite citometria a flusso, ma richiede che i neutrofili siano preferenzialmente non associati a grandi aggregati di microbi in un biofilm28,29. La citometria a flusso può anche quantificare alcuni parametri del biofilm, come la vitalità cellulare27. Questi processi, tuttavia, richiedono la rottura della biomassa del biofilm e non sarebbero utili per visualizzare altre importanti interazioni come la distribuzione spaziale dei neutrofili e dei loro componenti all’interno di un biofilm27,29,30.
Il presente protocollo si concentra sull’adattamento di alcuni dei metodi tradizionalmente utilizzati per studiare le interazioni neutrofili-biofilm su biofilm che sono stati ottimizzati per fornire una variabilità minima durante la manipolazione. Questo protocollo fornisce quindi metodi standardizzati per coltivare e quantificare biofilm, isolare i neutrofili umani primari dal sangue periferico, quantificare la produzione di ROS e visualizzare le interazioni biofilm-neutrofili tramite microscopia. Questo protocollo può essere adattato a diversi sistemi per comprendere le interazioni biofilm-neutrofili considerando l’eterogeneità tra i pool di donatori.
Ci sono stati numerosi sforzi per far crescere biofilm di S. aureus robusti e riproducibili per esperimenti a valle in vitro48,49,50. Viene delineato un protocollo standardizzato che sfrutta la natura cationica del PLL, oltre a integrare i terreni con glucosio per la crescita di robusti biofilm in vitro di S. aureus. L’aggiunta di PLL consente un migliore fissaggio della cellula batterica caricata negativamente alle superfici rivestite PLL caricate positivamente. È importante notare che PLL a una concentrazione di 10 μg/mL ha attività antimicrobica contro Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e S. aureus quando incubato per 24 ore51. La stessa concentrazione viene utilizzata per rivestire le superfici; tuttavia, il PLL in eccesso viene aspirato, rendendo la concentrazione di PLL inferiore a 10 μg / ml durante la semina per la crescita del biofilm.
È importante notare che PLL ha funzionato solo in specifici terreni di crescita come MEMα con glucosio al 2%, dove è stato osservato che S. aureus produceva biofilm robusti con una variabilità minima (Figura 2A). La concentrazione di PLL da utilizzare in combinazione con altri tipi di fluidi richiederebbe un’ulteriore ottimizzazione, ad esempio utilizzando una maggiore concentrazione di PLL per rivestire i pozzi. Inoltre, queste condizioni sono state ottimizzate per un biofilm monospecie di S. aureus. Mentre i biofilm cronici delle ferite sono spesso polimicrobici, standardizzare i saggi per studiare il biofilm monospecie e le sue interazioni con i neutrofili e altre cellule immunitarie è fondamentale per comprendere il loro contributo alla patogenesi52. Questi protocolli standardizzati possono essere ulteriormente ottimizzati per sostenere e studiare i biofilm polimicrobici e le loro interazioni con i neutrofili.
È stato anche osservato che ricchi terreni di coltura batterica, come TSB, hanno portato a una perdita di vitalità dei neutrofili (Figura 1). Pertanto, le condizioni di crescita dei biofilm di S. aureus in MEMα, utilizzati per colture cellulari di mammifero, sono state ottimizzate. Per gli studi che coinvolgono i neutrofili, questo mezzo supporta la vitalità dei neutrofili e promuove la crescita di S. aureus. Mentre è stato osservato che i media influenzano la vitalità dei neutrofili, è anche importante considerare che i neutrofili isolati dal sangue umano periferico vanno incontro ad apoptosi ex vivo con circa il 70% di neutrofili apoptotici entro 20 h53. Ciò richiede una corretta manipolazione, come la conservazione dei neutrofili sul ghiaccio durante la preparazione per gli esperimenti, l’uso di reagenti privi di endotossine e la prevenzione dell’attivazione dei neutrofili evitando il vortice dei campioni con neutrofili.
La valutazione del burst ossidativo nei neutrofili viene eseguita di routine per determinare l’effetto di uccisione dei neutrofili sul patogeno14,54,55. Questi studi sono spesso eseguiti con batteri planctonici in cui vengono aggiunti neutrofili e la risposta di scoppio ossidativo viene quantificata utilizzando chemiluminescenza amplificata da luminolo che rileva gli anioni superossido prodotti dai neutrofili. Il presente protocollo viene modificato sostituendo i batteri planctonici con biofilm 18 h S. aureus coltivato staticamente. Pertanto, i neutrofili possono essere aggiunti direttamente al biofilm per valutare la loro attivazione. D’altra parte, i batteri nei biofilm producono enzimi, come la catalasi e la superossido dismutasi per disintossicare ROS23,56. I biofilm di Staphylococcus epidermidis producono una catalasi superiore rispetto alla sua controparte planctonica sotto stress57. La chemiluminescenza totale dei neutrofili stimolati da PMA in un biofilm di S. aureus è significativamente inferiore rispetto ai neutrofili stimolati da PMA in cui il biofilm è assente (Figura 2). Ciò può essere dovuto all’attività di questi enzimi disintossicanti. Inoltre, i biofilm di S. aureus producono diverse tossine che formano pori chiamate leucocidine che uccidono i neutrofili58. La ridotta risposta al burst è probabilmente dovuta anche alla ridotta vitalità dei neutrofili in presenza del biofilm di S. aureus. Mentre questo studio utilizza luminolo che rileva i ROS totali prodotti sia all’interno che all’esterno delle cellule, altri reagenti, come CM-H 2 DCFDA (5-(e-6)-clorometil-2’7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato) o isoluminolo, devono essere considerati se l’obiettivodel lavoro è studiare specificamente la produzione di ROS intracellulari o extracellulari 14,53,54.
La capacità di visualizzare le interazioni neutrofili-biofilm tramite microscopia può essere informativa sul comportamento dei neutrofili e dei biofilm in presenza l’uno dell’altro. Gli spettri di eccitazione ed emissione dei coloranti fluorescenti e delle proteine rappresentano un’istantanea dell’interazione tra un biofilm di 18 h S. aureus e neutrofili dopo un’incubazione di 30 minuti. Per catturare efficacemente i segnali dalle cellule colorate, è importante limitare l’esposizione dei campioni alle sorgenti luminose durante la configurazione dei campioni per la microscopia. Durante l’imaging, è stato evitato il rapido fotosbiancamento dei campioni abbassando l’intensità della sorgente luminosa durante la regolazione di tutti i parametri come l’altezza dello stack Z e il tempo di esposizione per i diversi canali.
Queste semplici pratiche hanno permesso una corretta imaging al microscopio in cui è stato osservato che pochi neutrofili sono localizzati all’interno del biofilm (Figura 4A). Ciò può essere dovuto agli spazi presenti all’interno del biofilm poiché il biofilm di S. aureus 18 h coltivato in MEMα con glucosio al 2% non copre uniformemente la superficie (Figura 4B). Tuttavia, l’uso di altri studi di rich media ha mostrato un prato uniforme di crescita del biofilm di S. aureus e leucociti che penetrano attraverso il biofilm30,58. Inoltre, si osserva anche che c’è stata morte delle cellule neutrofile dopo 30 minuti di incubazione con biofilm di S. aureus a causa di leucocidine prodotte da biofilm di S. aureus che lisano i neutrofili58 (Figura 4A,D). L’aggiunta di una fase di lavaggio per rimuovere i neutrofili non aderenti dopo averli incubati con biofilm per 30 minuti ha rimosso ~ 15% di neutrofili morti dal sistema rispetto al gruppo non lavato, in cui la microscopia è stata eseguita immediatamente dopo 30 minuti di incubazione (Figura 4D). Sono stati osservati anche neutrofili che interagiscono con S. aureus (Figura 4C). Sono necessari ulteriori esperimenti per valutare se S. aureus è inghiottito dai neutrofili o attaccato alla superficie cellulare dei neutrofili54. L’imaging di neutrofili e biofilm è il primo passo per valutare diverse funzionalità dei neutrofili a valle, come la fagocitosi e la NETosi54,59. L’effetto dei neutrofili sui biofilm può anche essere valutato quantificando la biomassa del biofilm, i cambiamenti strutturali del biofilm e la vitalità del biofilm, tra molti altri, utilizzando gli strumenti di analisi delle immagini elencati nella fase 5.6. Infine, esiste una variabilità da donatore a donatore nei neutrofili; Pertanto, si raccomanda di utilizzare almeno tre diversi donatori per studi che coinvolgono i neutrofili.
Nel complesso, sono stati combinati saggi in vitro standardizzati per valutare le interazioni tra neutrofili e biofilm. Sebbene questi test utilizzino S. aureus, i protocolli descritti possono essere facilmente adattati per studiare altri agenti patogeni. Mentre ci sono vari modelli in vivo per studiare le interazioni ospite-patogeno, possono essere costosi e laboriosi, specialmente se le condizioni non sono ottimizzate. Lavorare con saggi standardizzati in vitro consente di ottimizzare le condizioni sperimentali e confermare le osservazioni prima di passare a un sistema in vivo. Infine, vari modelli di infezione animale sono stati utilizzati per studiare le interazioni biofilm-neutrofili in vivo. Tuttavia, è importante considerare le differenze immunologiche tra esseri umani e modelli animali60,61,62,63. Ciò richiede l’uso di neutrofili derivati dall’uomo per studiare queste complesse interazioni ospite-patogeno.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) a DJW e un American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) a ESG. Ringraziamo il Dr. Paul Stoodley per averci fornito il ceppo USA 300 LAC GFP. Inoltre, riconosciamo le risorse del Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) e dell’OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), The Ohio State University. Ringraziamo anche Amelia Staats, Peter Burback e Lisa Coleman del laboratorio Stoodley per aver eseguito prelievi di sangue.
0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
Band-aids | Used for blood draw | ||
BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
Hemacytometer | Bright Line | ||
Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
Luminol | Sigma | A8511-5G | |
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Turnicate | Used for blood draw | ||
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |