JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

فحوصات موحدة في المختبر لتصور وتحديد التفاعلات بين العدلات البشرية والمكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية

Published: June 08, 2022
doi:
10.3791/63773
, ,
1Department of Microbiology,The Ohio State University, 2Department of Microbial Infection and Immunity,The Ohio State University

Summary

يصف هذا البروتوكول دراسة تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي. يتم إنشاء الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية الذهبية في المختبر ويتم تحضينها بعدلات بشرية مشتقة من الدم المحيطي. يتم تحديد استجابة الانفجار التأكسدي من العدلات ، ويتم تحديد توطين العدلات داخل الغشاء الحيوي بواسطة الفحص المجهري.

Abstract

العدلات هي خط الدفاع الأول الذي ينشره الجهاز المناعي أثناء العدوى الميكروبية. في الجسم الحي ، يتم تجنيد العدلات إلى موقع العدوى حيث تستخدم عمليات مثل البلعمة ، وإنتاج الأكسجين التفاعلي وأنواع النيتروجين (ROS ، RNS ، على التوالي) ، NETosis (مصيدة العدلات خارج الخلية) ، وإزالة التحلل لقتل الميكروبات وحل العدوى. تمت دراسة التفاعلات بين العدلات والميكروبات العوالق على نطاق واسع. كانت هناك اهتمامات ناشئة في دراسة العدوى التي تسببها الأغشية الحيوية في السنوات الأخيرة. تظهر الأغشية الحيوية خصائص ، بما في ذلك تحمل القتل بواسطة العدلات ، متميزة عن نظيراتها المزروعة بالعوالق. مع الإنشاء الناجح لكل من نماذج الأغشية الحيوية في المختبر وفي الجسم الحي ، يمكن الآن التحقيق في التفاعلات بين هذه المجتمعات الميكروبية مع الخلايا المناعية المختلفة. هنا ، تم تصميم التقنيات التي تستخدم مزيجا من نماذج الأغشية الحيوية التقليدية ومقايسات نشاط العدلات الراسخة خصيصا لدراسة تفاعلات العدلات والأغشية الحيوية. يستخدم المجهر الفلوري واسع المجال لمراقبة توطين العدلات في الأغشية الحيوية. تزرع هذه الأغشية الحيوية في ظروف ثابتة ، تليها إضافة العدلات المشتقة من الدم المحيطي البشري. يتم تلطيخ العينات بالأصباغ المناسبة قبل التصور تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد إنتاج ROS ، وهو أحد استجابات العدلات العديدة ضد مسببات الأمراض ، في وجود غشاء حيوي. ستؤدي إضافة الخلايا المناعية إلى هذا النظام القائم إلى توسيع فهم التفاعلات بين المضيف ومسبب المرض مع ضمان استخدام الظروف الموحدة والمحسنة لقياس هذه العمليات بدقة.

Introduction

الغشاء الحيوي الرقيق هو مجتمع من الميكروبات المرتبطة بالسطح أو الركام غير المرتبط المغلف بمادة بوليمرية خارج الخلية (EPS)1,2. تحمي هذه المجتمعات الكائنات الحية الدقيقة المغلفة من الضغوطات البيئية ، بما في ذلك تحمل العوامل المضادة للميكروبات والجهاز المناعي3. تشكل العديد من الأنواع الميكروبية المسببة للأمراض الأغشية الحيوية التي ارتبطت بالعدوى المزمنة4. تطوير الأغشية الحيوية هو عملية معقدة تنطوي على التعلق بالأسطح ، وإنتاج EPS ، وتكاثر الخلايا ، وهيكلة الأغشية الحيوية ، وانفصال الخلية5. بمجرد أن تتشتت الخلايا لتشكل غشاء حيوي، فإنها تظل عوالق أو تنتقل إلى طبقة تحتية جديدة وتعيد بدء تطور الأغشية الحيوية6.

تتبع المكورات العنقودية الذهبية ، وهي ممرض انتهازي ، مخططا عاما لتطور الأغشية الحيوية ، بما في ذلك التعلق والانتشار والنضج والتشتت7. تملي عملية التعلق في الأغشية الحيوية S. aureus من خلال التفاعلات الكارهة للماء ، وأحماض teichoic ، ومكونات السطح الميكروبية التي تتعرف على جزيئات المصفوفة اللاصقة (MSCRAMMs)8,9. مع بدء تكاثر العقدية الذهبية ، يتم إنتاج EPS ، الذي يتكون بشكل أساسي من السكريات والبروتينات والحمض النووي خارج الخلية وأحماض teichoic ،5. أثناء إنتاج مكونات EPS ، يتم أيضا إنتاج العديد من الإنزيمات الخارجية والجزيئات الصغيرة ، مما يساهم في بنية الأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد ويساعد في الانفصال5. تستفيد S. aureus من نمط الحياة المنسق للغاية هذا لإنشاء العديد من الالتهابات المزمنة ، بما في ذلك الالتهابات الناجمة عن سكن الأجهزة الطبية10.

تعد المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) أحد الأسباب الرئيسية للعدوى المتعلقة بالأجهزة الطبية الساكنة ، مثل القسطرة الوريدية والبولية المركزية ، والمفاصل الاصطناعية ، وأجهزة تنظيم ضربات القلب ، وصمامات القلب الميكانيكية ، والأجهزة داخل الرحم11. خلال مثل هذه العدوى ، تكون العدلات هي أول خلايا مناعية مضيفة يتم تجنيدها في موقع العدوى لمكافحة مسببات الأمراض عبر استراتيجيات متعددة12. وتشمل هذه البلعمة ، وإزالة الحبيبات ، وإنتاج أنواع الأكسجين والنيتروجين التفاعلية (ROS / RNS) ، أو إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) للقضاء على مسببات الأمراض13.

يعد توليد أنواع الأكسجين التفاعلية عند البلعمة من الميكروبات أحد الاستجابات الرئيسية المضادة للميكروبات التي تظهرها العدلات14. تتعزز البلعمة إذا كانت الميكروبات مغلفة بالأوبسونين ، وخاصة الغلوبولين المناعي والمكونات التكميلية الموجودة في المصل15. ثم يتم التعرف على الميكروبات الأوبسونية بواسطة مستقبلات سطح الخلية على العدلات وتبتلعها ، وتشكل حجرة تسمى البلعمة15. تولد العدلات وتطلق أنواع الأكسجين التفاعلية في البلعمة عبر NADPH-oxidase16 المرتبط بالغشاء. يولد مركب الإنزيم متعدد المكونات هذا أنيونات الأكسيد الفائق عن طريق نقل الإلكترونات إلى الأكسجين الجزيئي16. بالإضافة إلى ذلك ، تولد العدلات أيضا RNS من خلال التعبير عن سينسيز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS)17. هذه الجذور عالية الأكسيد وأكسيد النيتريك داخل البلعمة لها أنشطة واسعة مضادة للميكروبات. يمكن أن تتفاعل مع المراكز المعدنية في الإنزيمات وتتلف الأحماض النووية والبروتينات والأغشية الخلوية لمسبب المرض18،19،20،21. تتبنى العديد من الميكروبات أسلوب حياة الأغشية الحيوية وتوظف استراتيجيات مختلفة للتهرب من القتل بواسطة ROS22,23. وبالتالي ، فإن المقايسات الموحدة التي تربط الأغشية الحيوية مع العدلات لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية مفيدة للحصول على نتائج متسقة.

في حين أن المقايسات ، مثل تحديد إنتاج ROS العدلات ، توفر معلومات حول استجابات العدلات للأغشية الحيوية ، فإن القدرة على تصور تفاعلات العدلات داخل الأغشية الحيوية يمكن أن تكون أيضا بمثابة أداة قوية. غالبا ما يتطلب استخدام الأصباغ الفلورية للفحص المجهري تحسينا للحصول على صور عالية الجودة يمكن استخدامها لتحليل التصوير المجهري. المرونة لتحسين بعض الظروف محدودة حيث يمكن أن تخضع العدلات لموت الخلايا بعد العزل. علاوة على ذلك ، يتم غسل الأغشية الحيوية عادة لإزالة العوالق من الإعداد التجريبي قبل إضافة العدلات. أثناء الغسيل ، قد ينشأ التباين بين الأغشية الحيوية المكررة بسبب فقدان الكتلة الحيوية الجزئية إذا كانت الأغشية الحيوية ملتصقة بشكل فضفاض بالسطح.

على نطاق واسع ، تشمل الطرق الحالية في هذا المجال لتحليل التفاعلات بين العدلات والأغشية الحيوية بشكل أساسي الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي وتعداد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU)24،25،26،27. يتضمن الفحص المجهري استخدام الأصباغ التي إما تلطخ العدلات والأغشية الحيوية مباشرة ، أو تستهدف استجابات العدلات المختلفة ضد الميكروبات مثل تكوين NET ، والتحلل ، وموت الخلايا25,28. يمكن أيضا تحليل مجموعة فرعية من هذه الاستجابات ، مثل موت الخلايا العدلة وتحلل الخلايا ، عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ولكنها تتطلب أن تكون العدلات غير مرتبطة بشكل تفضيلي بمجاميع كبيرة من الميكروبات في الغشاء الحيوي28,29. يمكن لقياس التدفق الخلوي أيضا تحديد بعض معلمات الأغشية الحيوية ، مثل صلاحية الخلية27. ومع ذلك ، تتطلب هذه العمليات تعطيل الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي ولن تكون مفيدة لتصور تفاعلات مهمة أخرى مثل التوزيع المكاني للعدلات ومكوناتها داخل الغشاء الحيوي27،29،30.

يركز البروتوكول الحالي على تكييف بعض الطرق المستخدمة تقليديا لدراسة تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي على الأغشية الحيوية التي تم تحسينها لتوفير الحد الأدنى من التباين أثناء المناولة. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول طرقا موحدة لزراعة الأغشية الحيوية وقياسها كميا ، وعزل العدلات البشرية الأولية عن الدم المحيطي ، وتحديد إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتصور تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات عبر الفحص المجهري. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أنظمة مختلفة لفهم تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات مع مراعاة عدم التجانس بين تجمعات المانحين.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة ولاية أوهايو (IRB) (2014H0154). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين لجمع الدم المحيطي لعزل العدلات البشرية الأولية. تم استخدام المكورات العنقودية الذهبية (USA300 LAC)31 ككائن نموذجي لإجراء التجارب. تم إجراء التجارب باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بسبب التعرض المحتمل لمسببات الأمراض المنقولة بالدم. 1. تحضير الأغشية الحيوية المختبرية احصل على مستعمرات معزولة من S. aureus من مخزون محفوظ بالتبريد31 باستخدام تقنية لوحة مخططة32,33 على صفيحة أجار غنية بالمغذيات ، مثل Tryptic Soy Agar (انظر جدول المواد). قم بتغطية الآبار الفردية للوحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من 0.001٪ (v / v) poly-L-Lysine (PLL) المخفف في H2O المعقم واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بشكل معقم ، قم بشفط محلول PLL باستخدام مصيدة شفط بمساعدة الفراغ. اترك الآبار تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الشفط في البروتوكول باستخدام مصيدة شفط بمساعدة الفراغ ما لم ينص على خلاف ذلك. قم بإعداد مزرعة ليلية عن طريق تلقيح مستعمرة من S. aureus في الحد الأدنى من الوسائط الأساسية ألفا (MEMα) المكملة بجلوكوز 2٪ واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، وتهتز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة. قم بتخفيف الثقافة الليلية عن طريق نقل 50 ميكرولتر إلى 5 مل من MEMα الطازج المكمل بجلوكوز 2٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، والاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة ، حتى منتصف المرحلة اللوغاريتمية ، بشكل عام بين الكثافة البصرية 600 (OD600 نانومتر) من 0.5-0.8. استخدم MEMα لتطبيع الثقافة اللوغاريتمية المتوسطة إلىOD 600nm من 0.1. انقل 150 ميكرولتر من الاستزراع الطبيعي إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا المعالجة ب BILL. احتضان ثابت لمدة 18-20 ساعة في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: يمكن أيضا زراعة الأغشية الحيوية بتنسيقات أخرى مثل شرائح μ القناة (انظر جدول المواد). نضح الطاف لإزالة الخلايا العوالق. اغسل الكتلة الحيوية المتبقية برفق باستخدام 150 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن (HBSS) من هانكس لإزالة الخلايا غير المرتبطة. أضف HBSS قطرة لتجنب تعطيل الغشاء الحيوي.ملاحظة: أثناء استنشاق المادة الطافية و HBSS أثناء الغسيل ، اترك سائلا كافيا (طاف أو HBSS) في الآبار التي تحتوي على غشاء حيوي بحيث لا يزال الغشاء الحيوي مغمورا. هذا يمنع تعطيل بنية الأغشية الحيوية عند إضافة HBSS بالتنقيط لغسل الغشاء الحيوي. كرر الخطوة 1.6 مرتين أخريين على الأقل لإزالة جميع خلايا العوالق. في هذه المرحلة ، تكون الأغشية الحيوية جاهزة للتجارب الفورية في المصب.ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأغشية الحيوية في تجارب العدلات ، فيمكن استبدال HBSS بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يفضل HBSS على PBS حيث يحتوي HBSS على مكونات ، بما في ذلك الجلوكوز ، التي توفر الظروف المثلى لتنشيط العدلات34. 2. القياس الكمي للكتلة الحيوية للغشاء الحيوي قم بإعداد مخزون بنسبة 0.1٪ (وزن / حجم) محلول بنفسجي بلوري (CV) (انظر جدول المواد) عن طريق الذوبان في 20٪ (v / v) إيثانول و 80٪ (v / v) H 2 O. تأكدمن إذابة السيرة الذاتية تماما في الإيثانول قبل إضافة H2O. قم بتصفية وتعقيم المحلول. أضف 150 ميكرولتر من محلول CV 0.1٪ إلى الغشاء الحيوي المغسول واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم ثلاثة آبار فارغة على الأقل كعناصر تحكم للوسائط فقط. استنشاق محلول CV 0.1٪ من الأغشية الحيوية وغسل الأغشية الحيوية الملطخة ب 200 ميكرولتر من 1x PBS. كرر هذه العملية لما مجموعه ثلاث غسلات لإزالة أي سيرة ذاتية زائدة من الآبار. أضف 150 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي المخفف بنسبة 33٪ (v / v) المخفف ب H2O. احتضان في درجة حرارة الغرفة على هزاز عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة للسماح للسيرة الذاتية المرتبطة بالكتلة الحيوية بالذوبان تماما.تنبيه: نفذ هذه الخطوة في غطاء التدفق الصفحي مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة لأن حمض الخليك الجليدي مادة كيميائية أكالة. في غضون ذلك ، قم بإعداد قارئ الصفائح الدقيقة (انظر جدول المواد) لقراءة قيم صبغة السيرة الذاتية. بعد معالجة حمض الخليك الجليدي ، اقرأ اللوحة بطول موجة 595 نانومتر.ملاحظة: يمكن أن يتراوح الطول الموجي المستخدم لقياس OD ل CV من 500-600 نانومتر35. 3. عزل العدلات ملاحظة: تم عزل العدلات باتباع طريقة منشورة مسبقا مع تغييرات طفيفة36. يجمع بروتوكول العزل هذا بين الطرد المركزي المتدرج الكثافة أولا ، يليه ترسيب ديكستران بنسبة 3٪. يغطي هذا القسم فقط بروتوكول عزل العدلات الشامل ، مع التركيز على التغييرات التي تم إجراؤها على البروتوكول المنشور. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول الموضح أدناه هو أحد الطرق العديدة التي يمكنها عزل العدلات ، ويمكن استبدالها حسب الحاجة. تشمل الطرق الأخرى لعزل العدلات استخدام وسائط فصل الخلايا أو فصل خلايا الأجسام المضادة المغناطيسية37. سحب الدم من متبرع بالغ عن طريق بزل الوريد ، وفقا للبروتوكول الموضح في IRB المؤسسي. قبل سحب الدم ، تأكد من أن المحقنة تحتوي على ما يكفي من الهيبارين الخالي من المواد الحافظة ، بحيث يكون التركيز النهائي للهيبارين 20 وحدة / مل. تمييع الدم الهيبارين مع 3/4 حجم خالية من السموم الداخلية 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم (انظر جدول المواد) في H2O في درجة حرارة الغرفة. لكل 20 مل من عينة الدم المخففة ، حاصل 14 مل من وسط تدرج الكثافة المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. ضع بعناية عينة الدم المخففة فوق وسط تدرج الكثافة. جهاز طرد مركزي لعينة الدم ذات الطبقات عند 400 × جم لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن جهاز الطرد المركزي لديه كسر بطيء لتجنب إزعاج الطبقة بمجرد اكتمال الطرد المركزي.ملاحظة: ستحتوي عينة الدم على خمس طبقات تحتوي على خليط من المحلول الملحي والبلازما ، وطبقة خلية أحادية النواة ، ووسط تدرج الكثافة ، والعدلات ، وكريات الدم الحمراء. باستخدام ماصة مصلية ، استنشاق جميع الطبقات فوق العدلات وحبيبات كرات الدم الحمراء ، متبوعة بإعادة تعليق لطيفة للحبيبات في 0.9٪ كلوريد الصوديوم الخالي من السموم الداخلية الباردة في H2O. لكل حبيبة تم إنشاؤها من عينة دم 20 مل ، أعد تعليق الحبيبات مرة أخرى إلى إجمالي حجم 20 مل. أضف حجم 1: 1 من ديكستران 3٪ (انظر جدول المواد). احتضان الأنبوب في وضع مستقيم لمدة 18-20 دقيقة على الجليد.ملاحظة: تأكد من أن ديكستران 3٪ مصنوع من كلوريد الصوديوم 0.9٪ خال من السموم الداخلية في H2O. قم بإزالة 20 مل من الطبقة العليا التي تحتوي على العدلات وبعض كريات الدم الحمراء على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 355 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اسكب الطافت تاركا وراءه كرية حمراء. أعد تعليق الحبيبات برفق في 10 مل من H2O البارد والمعقم لمدة 30 ثانية لتحلل كريات الدم الحمراء المتبقية. أضف على الفور 10 مل من محلول ملحي بارد خال من السموم الداخلية بنسبة 0.9٪ إلى الخليط لاستعادة التوتر. جهاز طرد مركزي للمحلول عند 233 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على 95٪ -97٪ من العدلات في 1 مل HBSS بارد لكل 20 مل من عينة الدم. نقل 10 ميكرولتر من العدلات المعاد تعليقها في 90 ميكرولتر من صبغة استبعاد التريبان الزرقاء بنسبة 0.4٪ وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم (انظر جدول المواد).ملاحظة: الخلايا غير القابلة للحياة ملطخة باللون الأزرق لأن صبغة استبعاد التريبان الزرقاء غير منفذة في الخلايا القابلة للحياة. يوفر هذا البروتوكول >99٪ صلاحية الخلية37,38. أضف HBSS إضافيا بحيث يكون التركيز النهائي للعدلات 4 × 106 خلايا / مل.ملاحظة: بالنسبة للحالات التي تتمتع فيها بصلاحية خلية <99٪ ، لا يزال من الممكن تحقيق التركيز النهائي البالغ 4 × 106 خلايا / مل ؛ ومع ذلك ، فإن الحجم الكلي للمحلول الذي يحتوي على 4 × 106 خلايا / مل تم الحصول عليها سينخفض. يمكن تعديل التركيز النهائي للعدلات وفقا لاحتياجات المستخدم التجريبية. تم إعادة تعليق العدلات بتركيز نهائي 4 × 106 خلايا / مل لجميع التجارب الموضحة أدناه. لمراعاة التباين من مانح إلى متبرع ، يوصى بشدة بإجراء جميع التجارب التي تنطوي عليها العدلات مع ثلاثة متبرعين مختلفين على الأقل. 4. قياس أنواع الأكسجين التفاعلية التي تنتجها العدلات أضف 100 ميكرولتر من مصل بشري طبيعي بنسبة 20٪ (مخفف في HBSS) بالتنقيط إلى الغشاء الحيوي المغسول (الخطوة 1.6) واحتضانه عند 37 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة لمدة 30 دقيقة لامتصاص الغشاء الحيوي. شفاط محلول المصل 20٪ واغسل الأغشية الحيوية بالتنقيط باستخدام 150 ميكرولتر من HBSS مرة واحدة. نضح HBSS ، تاركا وراءه آبارا ذات أغشية حيوية أوبسونية.ملاحظة: لتفسير التجربة، يوصى بأربع مجموعات على الأقل: (أ) العدلات + الأغشية الحيوية، (ب) العدلات + PMA (التحكم الإيجابي، انظر جدول المواد)، (ج) العدلات فقط، (د) الأغشية الحيوية فقط. أضف لومينول (انظر جدول المواد) إلى العدلات المعاد تعليقها في HBSS بتركيز 4 × 106 خلايا / مل بحيث يكون تركيز اللومينول النهائي 50 ميكرومتر. هذا الحل جاهز للاستخدام للمجموعتين (أ) و(ج). أضف 4 × 105 عدلات ممزوجة باللومينول إلى الآبار مع الأغشية الحيوية الأوبسونية. في أنبوب منفصل ، قم بإعداد محلول لومينول 50 ميكرومتر في HBSS دون أي عدلات وأضفه إلى البئر الذي يحتوي على الأغشية الحيوية (المجموعة D). حصة 350 ميكرولتر من العدلات الممزوجة مع اللومينول وإضافة phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) بتركيز نهائي قدره 500 نانوغرام / مل إلى الخليط. بالنسبة إلى المجموعة (ب)، أضف 4 × 105 عدلات من هذا الخليط إلى آبار بدون غشاء حيوي. هذا بمثابة السيطرة الإيجابية.ملاحظة: تركيز PMA المشار إليه في هذه الخطوة مرتفع نسبيا لضمان استجابة قوية للانفجار حيث أن العدلات المحفزة PMA هي عنصر تحكم إيجابي. يمكن استخدام PMA بتركيز أقل لتنشيط العدلات ، اعتمادا على التجربة. جهاز طرد مركزي للوحة عند 270 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. تأكد من ضبط قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية مع إعداد التلألؤ والقراءة الحركية لمدة 60 دقيقة بفواصل زمنية مدتها 3 دقائق. ضع اللوحة في قارئ اللوحة لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات لمدة 60 دقيقة.ملاحظة: بالنسبة لهذا الفحص ، تمت زراعة الأغشية الحيوية في ألواح بيضاء تستخدم في فحوصات التلألؤ. PMA هو ناهض معروف لاستجابة الانفجار التأكسدي39. عند إجراء دراسات تتضمن PMA ، تأكد من إضافة PMA في الخطوة الأخيرة بينما يكون المحلول الذي يحتوي على العدلات باردا لأن PMA يبدأ على الفور استجابة الانفجار. 5. تصوير تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات قم بإعداد غشاء حيوي باستخدام الخطوات 1.2-1.6. لتسهيل التصوير بالأغشية الحيوية، استخدم سلالة فلورية من المكورات العنقودية الذهبية، مثل USA300 التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP)40،41، لزيادة سهولة التصوير المجهري.ملاحظة: تم استخدام شريحة ذات 6 قنوات μ (انظر جدول المواد) بدلا من لوحة ذات 96 بئرا لتوضيح نموذج الأغشية الحيوية في المختبر (الخطوة 1). احتضان 4 × 106 خلايا / مل من العدلات مع 100 ميكرومتر من صبغة CMAC الزرقاء (7-أمينو-4-كلوروميثيل كومارين) (BCD ، انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في الروك عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تأكد من تحضين العينات في الظلام والحد من التعرض للضوء للخطوات المتبقية. لغسل BCD الزائد ، العدلات الطرد المركزي في 270 × غرام لمدة 5 دقائق وشفط الطاف. أعد تعليق العدلات في HBSS الطازجة. في هذه المرحلة ، أضف إيثيديوم هوموديمر -1 (انظر جدول المواد) إلى العدلات الملطخة ب BCD بتركيز نهائي قدره 4 ميكرومتر لمراقبة العدلات والموت البكتيري. أضف 150 ميكرولتر من العدلات إلى الغشاء الحيوي S . aureus الذي نما في شرائح μ ، بحيث تكون نسبة العدلات إلى البكتيريا 1:30 (العدلات: البكتيريا). احتضان شرائح μ في غرفة مرطبة لمدة 30 دقيقة. يعتمد عدد الخلايا البكتيرية على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من طلاء غشاء حيوي لمدة 18 ساعة. تصوير تفاعل العدلات والغشاء الحيوي باستخدام قنوات الفلورسنت المقابلة لأطوال موجات الإثارة والانبعاث للأصباغ / البروتينات الفلورية.ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، BCD هو 353/466 نانومتر ، إيثيديوم هوموديمر -1 هو 528/617 نانومتر ، و GFP هو 395/509 نانومتر. الحد من تعرض العينة لليزر أو الضوء لمنع التبييض الضوئي للعينات. قم بتحليل الصور باستخدام برامج أو برامج تحليل الصور المجهرية مثل FIJI / ImageJ و COMSTAT2 و BiofilmQ و BAIT ، من بين العديد من البرامج الأخرى42،43،44،45.ملاحظة: عند العمل مع البقع ، من المهم مراعاة خصوصية الأصباغ المستخدمة. تعمل بعض البقع على الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، بينما يعمل البعض الآخر على خلية واحدة فقط. إذا تم تلطيخ العدلات والأغشية الحيوية بشكل منفصل باستخدام أصباغ يمكن أن تلطخ كلا النوعين من الخلايا ، فتأكد من غسل أي صبغة متبقية قبل الجمع بين العدلات والأغشية الحيوية لمنع تلطيخ متقاطع.

Representative Results

تؤثر الوسائط المستخدمة لزراعة الأغشية الحيوية البكتيرية على بقاء العدلات. تم اختبار وسائط مختلفة لتقليل تأثير الوسائط وحدها على صلاحية العدلات لدراسة تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي (الشكل 1). تقلل وسائط النمو البكتيري مثل Tryptic Soy Broth من صلاحية العدلات ، بحيث ~ 60٪ من العدلات على قيد الحياة بعد فترة حضانة مدتها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. لا تؤثر وسائط زراعة خلايا الثدييات ، مثل MEMα ، على صلاحية العدلات وتدعم نمو الأغشية الحيوية S. aureus. في الواقع ، يعزز الحد الأدنى من الوسائط النمو القوي للأغشية الحيوية في البكتيريا الأخرى46,47. لتقييم تأثير الوسائط على نمو الأغشية الحيوية والتباين في تحديد كمية الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي بعد غسل الكتلة الحيوية للقضاء على الخلايا العوالق ، تم زراعة غشاء حيوي S. aureus لمدة 18 ساعة في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، مع معالجة الآبار أو معالجتها باستخدام poly-L-Lysine. تم استخدام وسائط غنية بالمغذيات (مرق الصويا التربتيك (TSB)) والحد الأدنى (MEMα) كما هي أو مكملة بجلوكوز 2٪. كشفت الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي الملطخة بالسيرة الذاتية أن الغشاء الحيوي S . aureus المزروع في MEMα المكمل بجلوكوز 2٪ أنتج الغشاء الحيوي الأقوى بين جميع الوسائط المختبرة (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، أظهرت الأغشية الحيوية المزروعة في آبار PLL المعالجة مسبقا التي تحتوي على MEMα + 2٪ جلوكوز تباينا أقل من الأغشية الحيوية في الآبار غير المعالجة التي تحتوي على MEMα + 2٪ جلوكوز. أظهرت هذه الأغشية الحيوية تباينا أقل في القياس الكمي عبر مقايسة CV35 و CFU / mL عند طلائها بعد التعامل بدقة مع الأغشية الحيوية لتحديد كمية الكتلة الحيوية. تحتوي هذه الأغشية الحيوية ، في المتوسط ، على 1 × 108 CFU / مل ، كما يتضح من طلاء الأغشية الحيوية في 3 أيام منفصلة (الشكل 2B). هذا الرقم مفيد في تحديد عدد العدلات التي يجب إضافتها إلى الأغشية الحيوية لمقايسات وظائف العدلات. لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات استجابة للأغشية الحيوية ، تمت زراعة الأغشية الحيوية S. aureus بشكل ثابت لمدة 18-20 ساعة في لوحة 96 بئرا. ثم تم استخدام الأغشية الحيوية ، وأضيفت العدلات. ثم تم قياس إنتاج ROS لمدة 60 دقيقة (الشكل 3 أ). يتم حساب المساحة الموجودة أسفل المنحنى من المنحنى الحركي لتحديد إجمالي إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات. تظهر العدلات المعالجة بناهض ، مثل PMA ، المستخدمة كعنصر تحكم ، زيادة في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. في غياب الأغشية الحيوية ، أظهرت العدلات المعالجة ب PMA إنتاجا قويا لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). في وجود S. aureus biofilm ، انخفض إجمالي إنتاج ROS بواسطة العدلات المعالجة ب PMA. في غياب PMA ، تعتمد العدلات فقط على تفاعلها مع الغشاء الحيوي ، مما يقلل من كمية أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة (الشكل 3 ب). لتصور تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي باستخدام المجهر الفلوري ، تم استخدام سلالة معبرة عن GFP من S. aureus وصبغة Blue CMAC و ethidium homodimer-1 ، التي تلطخ سيتوبلازم الخلايا الحية والحمض النووي للخلايا الميتة ، على التوالي. نمت S. aureus biofilm لمدة 18 ساعة في شريحة 6 μ القنوات. تمت إضافة العدلات الزرقاء ذات العلامات الصبغية CMAC جنبا إلى جنب مع إيثيديوم هوموديمر-1 إلى الأغشية الحيوية المغسولة وتم تحضينها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 قبل التصوير. كشف الفحص المجهري الفلوري واسع المجال أن العديد من العدلات كانت موضعية على سطح الأغشية الحيوية S. aureus ، في حين أن القليل منها موجود داخل الغشاء الحيوي (الشكل 4 أ). كان التفاعل بين خلايا المكورات العنقودية الذهبية داخل العدلات واضحا أيضا (الشكل 4C). كانت معظم خلايا S. aureus التي تتفاعل مع العدلات (سماوي) ميتة (أرجوانية) ، بينما بقي عدد قليل منها على قيد الحياة (أصفر) كما هو محدد من خلال تلطيخ الأحياء والموتى (الشكل 4C). وعلى سبيل المقارنة، كانت الأغشية الحيوية المكورات العنقودية الذهبية المعبرة عن GFP ملطخة بإيثيديوم هوموديمر-1، والتي كشفت عن جزء صغير من أعداد المكورات العنقودية الذهبية الميتة داخل الأغشية الحيوية (الشكل 4 ب). تم قياس العدلات غير القابلة للحياة التي كانت إيجابية ل ethidium homodimer-1 باستخدام برنامج التحليل (انظر جدول المواد) بعد الحضانة مع الأغشية الحيوية S. aureus. ما يقرب من 48 ٪ من العدلات قد ماتت بالفعل في غضون 30 دقيقة من الحضانة مع S. aureus biofilm. أثناء تحسين بروتوكول الفحص المجهري ، تم أيضا تقييم تأثير غسل الأغشية الحيوية والعدلات بعد 30 دقيقة من الحضانة لإزالة العدلات غير الملتصقة ، مما كشف عن حوالي 33٪ من العدلات الميتة التي لا تزال مرتبطة بالغشاء الحيوي (الشكل 4 د). الشكل 1: يقارن اختبار LIVE-DEAD بقاء العدلات بين وسائط النمو البكتيرية والثدييات. تم عزل العدلات وحضنها في HBSS أو MEMα أو TSB أو 0.1٪ SDS لمدة 30 دقيقة. تم إجراء تلطيخ LIVE-DEAD باستخدام Calcein AM (حي) وإيثيديوم هوموديمر -1 (ميت). تم تحديد النسبة المئوية للعدلات الحية ، حيث تم التعامل مع العدلات المحتضنة HBSS على أنها عدلات حية بنسبة 100٪. تمثل النتائج في المتوسط تجربتين مستقلتين تم إجراؤهما في ثلاث نسخ ، مع العدلات التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD (* p < 0.05 ، ****p < 0.0001. اتجاه واحد ANOVA). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: القياس الكمي للكتلة الحيوية للأغشية الحيوية في ظروف مختلفة وعدد الصلاحية البكتيرية للأغشية الحيوية المزروعة في الظروف المثلى. (أ) تم زرع S. aureus في صفيحة مكونة من 96 بئرا إما مطلية أو غير مطلية ببولي L-Lysine (PLL). نمت الأغشية الحيوية في TSB أو MEMα أو أي من الوسائط المكملة بجلوكوز 2٪ في ظل ظروف ثابتة لمدة 18 ساعة. تم إجراء تلطيخ الكريستال البنفسجي (CV) لتلطيخ الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي. تم تخفيف وصمة عار السيرة الذاتية في الساعة 1:10 وقراءتها في قارئ الصفيحة الدقيقة. تمثل النتائج في المتوسط ثلاث تجارب مستقلة أجريت في ثلاث نسخ. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. يظهر SD لكل مجموعة في الأسفل لإظهار تباين ظروف نمو الأغشية الحيوية المختلفة. (ب) تم الحصول على عدد CFU البكتيري من الأغشية الحيوية المزروعة في وسط محسن (MEMα + 2٪ جلوكوز). تم إخضاع الأغشية الحيوية الثابتة لمدة 18 ساعة لنفس العدد من عمليات الغسيل متبوعة بصوتنة لمدة 10 دقائق لتخفيف الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي وتمريرها عبر إبرة 22G لتعطيل الركام قبل الطلاء. تمثل النتائج ثلاث نسخ مكررة يتم إجراؤها في ثلاث نسخ. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD (ns = غير مهم. اتجاه واحد ANOVA). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: القياس الكمي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات عن طريق مقايسة التلألؤ الكيميائي. (أ) تم تحضين العدلات (PMN) بأغشية حيوية S. aureus المغسولة HBSS (BF) إما في وجود (مثلث رمادي مغلق) أو غياب (مثلث رمادي مقلوب مفتوح) ل PMA لقياس إنتاج ROS بواسطة العدلات. تم استخدام Luminol للكشف عن ROS كل 3 دقائق لمدة 60 دقيقة في قارئ microplate. في حين أن العدلات التي عولجت ب PMA في غياب الأغشية الحيوية (الدائرة السوداء المغلقة) كانت بمثابة عنصر تحكم إيجابي ، فإن مجموعات العدلات فقط (الدائرة السوداء المفتوحة) والأغشية الحيوية فقط (المثلث الرمادي المفتوح) كانت بمثابة عناصر تحكم سلبية. تمثل البيانات في المتوسط تجربتين مستقلتين تم إجراؤهما في ثلاث نسخ مع العدلات التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. (ب) تم حساب المساحة تحت المنحنى من (A) لتحديد إجمالي ROS الناتج عن العدلات. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD. (***p < 0.0001. اتجاه واحد ANOVA). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: تصور التفاعل بين الغشاء الحيوي للمكورات العنقودية الذهبية والعدلات باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال. تم استكمال العدلات الزرقاء CMAC ذات العلامات الصبغية (السماوي) بإيثيديوم هوموديمر -1 (أرجواني ؛ ميت) قبل الحضانة بغشاء حيوي S. aureus 18 ساعة (أصفر). تم تصوير تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال ومعالجة الصور باستخدام برنامج تحليل الصور. أجريت التجارب مع ثلاثة متبرعين مختلفين. يتم تقديم الصور التمثيلية على النحو التالي: (أ) عرض ثلاثي الأبعاد ل S. aureus biofilm مع العدلات الحية (السماوية) والميتة (أرجواني ؛ يشار إلى عدد قليل منها بأسهم بيضاء) ، (B) منظر ثلاثي الأبعاد لغشاء حيوي S. aureus في حالة عدم وجود عدلات مع S. aureus الحية التي تعبر عن GFP (الأصفر) أو الميتة S. aureus ملطخة بإيثيديوم هوموديمر -1 (أرجواني) ، (C) منظر متعامد للمكورات العنقودية الذهبية وتفاعل العدلات كما هو موضح في المستويات xy و yz و xz ، و (D) القياس الكمي لصلاحية العدلات في وجود الأغشية الحيوية S. aureus بعد 30 دقيقة إما على الفور (غير مغسولة) أو بعد ثلاث جولات من الغسيل باستخدام HBSS لإزالة العدلات غير الملتصقة (المغسولة). يتم تقديم موت خلايا العدلات كمتوسط ± SD (اختبار t للطالب). يشير شريط المقياس إلى 50 ميكرومتر في (A) و (B) و 10 ميكرومتر في (C). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

كانت هناك جهود عديدة لزراعة الأغشية الحيوية القوية والقابلة للتكرار S. aureus للتجارب النهائية في المختبر48،49،50. تم تحديد بروتوكول موحد يستفيد من الطبيعة الكاتيونية ل PLL ، بالإضافة إلى استكمال الوسائط بالجلوكوز لنمو الأغشية الحيوية القوية في المختبر S. aureus. تسمح إضافة PLL بربط أفضل للخلية البكتيرية سالبة الشحنة بالأسطح المطلية ب PLL المشحونة إيجابيا. من المهم ملاحظة أن PLL بتركيز 10 ميكروغرام / مل له نشاط مضاد للميكروبات ضد الزائفة الزنجارية والإشريكية القولونية و S. aureus عند حضنها لمدة 24 ساعة51. يتم استخدام نفس التركيز لطلاء الأسطح. ومع ذلك ، يتم استنشاق PLL الزائد ، مما يجعل تركيز PLL أقل من 10 ميكروغرام / مل عند البذر لنمو الأغشية الحيوية.

من المهم ملاحظة أن PLL قد عملت فقط في وسائط نمو محددة مثل MEMα مع 2٪ جلوكوز ، حيث لوحظ أن S. aureus أنتجت أغشية حيوية قوية مع الحد الأدنى من التباين (الشكل 2 أ). سيتطلب تركيز PLL الذي سيتم استخدامه جنبا إلى جنب مع أنواع الوسائط الأخرى مزيدا من التحسين ، مثل استخدام تركيز متزايد من PLL لتغطية الآبار. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين هذه الظروف لغشاء حيوي أحادي النوع S. aureus. في حين أن الأغشية الحيوية للجرح المزمن غالبا ما تكون متعددة الميكروبات ، فإن توحيد المقايسات لدراسة الأغشية الحيوية أحادية النوع وتفاعلاتها مع العدلات والخلايا المناعية الأخرى أمر أساسي في فهم مساهمتها في التسببفي المرض 52. يمكن تحسين هذه البروتوكولات الموحدة بشكل أكبر للحفاظ على الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات ودراستها وتفاعلاتها مع العدلات.

ولوحظ أيضا أن وسائط الاستزراع البكتيري الغنية، مثل TSB، أدت إلى فقدان صلاحية العدلات (الشكل 1). لذلك ، تم تحسين ظروف نمو الأغشية الحيوية S. aureus في MEMα ، المستخدمة في مزارع خلايا الثدييات. بالنسبة للدراسات التي تتضمن العدلات ، تدعم هذه الوسائط صلاحية العدلات وتعزز نمو العقدية الذهبية . بينما لوحظ أن الوسائط تؤثر على صلاحية العدلات ، من المهم أيضا مراعاة أن العدلات المعزولة من دم الإنسان المحيطي تخضع لموت الخلايا المبرمج خارج الجسم الحي مع ما يقرب من 70٪ من العدلات موت الخلايا المبرمج بحلول 20 ساعة53. وهذا يتطلب التعامل السليم ، مثل تخزين العدلات على الجليد عند التحضير للتجارب ، واستخدام الكواشف الخالية من السموم الداخلية ، ومنع تنشيط العدلات عن طريق تجنب دوامة العينات مع العدلات.

يتم إجراء تقييم الانفجار التأكسدي في العدلات بشكل روتيني لتحديد تأثير قتل العدلات على العامل الممرض14،54،55. يتم إجراء هذه الدراسات بشكل متكرر مع بكتيريا العوالق حيث تتم إضافة العدلات ، ويتم قياس استجابة الانفجار التأكسدي باستخدام التلألؤ الكيميائي المضخم للومينول الذي يكتشف أنيونات الأكسيد الفائق التي تنتجها العدلات. يتم تعديل البروتوكول الحالي عن طريق استبدال بكتيريا العوالق بغشاء حيوي S. aureus ينمو بشكل ثابت 18 ساعة. على هذا النحو ، يمكن إضافة العدلات مباشرة إلى الغشاء الحيوي لتقييم تنشيطها. من ناحية أخرى ، تنتج البكتيريا الموجودة في الأغشية الحيوية إنزيمات ، مثل الكاتلاز وديسموتاز الفائق لإزالة السموم من ROS23,56. تنتج الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية البشروية كاتالاز أعلى من نظيرتها العوالق تحت الضغط57. يكون التلألؤ الكيميائي الكلي للعدلات المحفزة ب PMA في الأغشية الحيوية S. aureus أقل بكثير من العدلات المحفزة ب PMA حيث لا يوجد غشاء حيوي (الشكل 2). قد يكون هذا بسبب نشاط هذه الإنزيمات المزيلة للسموم. علاوة على ذلك ، تنتج الأغشية الحيوية S. aureus العديد من السموم المكونة للمسام والتي تسمى leukocidins التي تقتل العدلات58. من المحتمل أيضا أن تكون استجابة الانفجار المنخفضة بسبب انخفاض صلاحية العدلات في وجود الأغشية الحيوية S. aureus. بينما تستخدم هذه الدراسة اللومينول الذي يكتشف إجمالي أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة داخل الخلايا وخارجها ، يجب مراعاة الكواشف الأخرى ، مثل CM-H 2 DCFDA (5- (و-6) -كلوروميثيل –2’7‘-ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين ثنائي الأسيتات) أو إيزولومينول ، إذا كان الهدف من العمل هو دراسة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا أو خارج الخلية14،53،54 على وجه التحديد.

يمكن أن تكون القدرة على تصور تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي عبر الفحص المجهري مفيدة حول سلوك العدلات والأغشية الحيوية في وجود بعضها البعض. تمثل أطياف الإثارة والانبعاث للأصباغ والبروتينات الفلورية لقطة للتفاعل بين الغشاء الحيوي S. aureus لمدة 18 ساعة والعدلات بعد حضانة مدتها 30 دقيقة. لالتقاط الإشارات بشكل فعال من الخلايا الملطخة ، من المهم الحد من تعرض العينات لمصادر الضوء أثناء إعداد العينات للفحص المجهري. أثناء التصوير ، تم تجنب التبييض الضوئي السريع للعينات عن طريق خفض شدة مصدر الضوء عند ضبط جميع المعلمات مثل ارتفاع Z-stack ووقت التعرض للقنوات المختلفة.

سمحت هذه الممارسات البسيطة بالتصوير المجهري المناسب حيث لوحظ أن عددا قليلا من العدلات موضعية داخل الغشاء الحيوي (الشكل 4 أ). قد يكون هذا بسبب المساحات الموجودة داخل الغشاء الحيوي حيث أن 18 ساعة من S. aureus biofilm المزروعة في MEMα مع 2٪ من الجلوكوز لا تغطي السطح بشكل موحد (الشكل 4B). ومع ذلك ، فقد أظهر استخدام دراسات أخرى للوسائط الغنية عشبا موحدا لنمو الأغشية الحيوية S. aureus والكريات البيض التي تخترق الغشاء الحيوي30,58. علاوة على ذلك ، لوحظ أيضا أنه كان هناك موت لخلايا العدلات بعد 30 دقيقة من الحضانة مع الأغشية الحيوية S. aureus بسبب leukocidins المنتجة من S. aureus biofilm التي تحللالعدلات 58 (الشكل 4A ، D). إضافة خطوة غسيل لإزالة العدلات غير الملتصقة بعد احتضانها بغشاء حيوي لمدة 30 دقيقة إزالة ~ 15٪ من العدلات الميتة من النظام مقارنة بالمجموعة غير المغسولة ، حيث تم إجراء الفحص المجهري مباشرة بعد 30 دقيقة من الحضانة (الشكل 4D). كما لوحظت العدلات التي تتفاعل مع S. aureus (الشكل 4C). هناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتقييم ما إذا كانت S. aureus غارقة في العدلات أو متصلة بسطح الخلية من العدلات54. يعد تصوير العدلات والأغشية الحيوية الخطوة الأولى لتقييم العديد من وظائف العدلات في اتجاه مجرى النهر ، مثل البلعمة و NETosis54,59. يمكن أيضا تقييم تأثير العدلات على الأغشية الحيوية من خلال تحديد الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي ، والتغيرات الهيكلية للغشاء الحيوي ، وصلاحية الأغشية الحيوية ، من بين أشياء أخرى كثيرة ، باستخدام أدوات تحليل الصور المدرجة في الخطوة 5.6. أخيرا ، يوجد تباين من مانح إلى مانح في العدلات. وبالتالي ، يوصى باستخدام ثلاثة متبرعين مختلفين على الأقل للدراسات التي تنطوي على العدلات.

بشكل عام ، تم الجمع بين المقايسات الموحدة في المختبر لتقييم التفاعلات بين العدلات والأغشية الحيوية. على الرغم من أن هذه المقايسات تستخدم المكورات العنقودية الذهبية ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف البروتوكولات الموصوفة لدراسة مسببات الأمراض الأخرى. في حين أن هناك العديد من النماذج في الجسم الحي لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض ، إلا أنها يمكن أن تكون باهظة الثمن وكثيفة العمالة ، خاصة إذا لم يتم تحسين الظروف. يسمح العمل مع المقايسات الموحدة في المختبر بتحسين الظروف التجريبية وتأكيد الملاحظات قبل الانتقال إلى نظام في الجسم الحي. أخيرا ، تم استخدام نماذج مختلفة للعدوى الحيوانية لدراسة تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات في الجسم الحي. ومع ذلك ، من المهم مراعاة الاختلافات المناعية بين البشر والنماذج الحيوانية60،61،62،63. وهذا يستلزم استخدام العدلات المشتقة من البشر لدراسة هذه التفاعلات المعقدة بين المضيف والممرض.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (R01AI077628) إلى DJW وجائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية (19CDA34630005) إلى ESG. نشكر الدكتور بول ستودلي على تزويدنا بسلالة USA 300 LAC GFP. علاوة على ذلك ، نحن نعترف بالموارد من مرفق الفحص المجهري والتصوير في الحرم الجامعي (CMIF) ومركز السرطان الشامل (OSUCCC) للفحص المجهري المشترك (MSR) ، جامعة ولاية أوهايو. كما نشكر أميليا ستاتس وبيتر بورباك وليزا كولمان من مختبر ستودلي على إجراء عمليات سحب الدم.

Materials

0.9% sodium chloride irrigation, USP Baxter 2F7124 Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils
150 mL rapid-flow filter unit Thermo Scientific 565-0020
200 proof ethanol VWR 89125-188
3 mL syringe BD 309657 Used for blood draw
50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339652
60 mL syringe BD 309653 Used for blood draw
Agar Fisher Bioreagents BP1423-2
Alcohol swab BD Used for blood draw
Band-aids Used for blood draw
BD Bacto Tryptic Soy Broth BD DF0370-07-5 Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar
Cell counter Bal Saupply 202C
CellTracker blue CMCH Invitrogen C2111 Blue CMAC Dye (BCD)
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates Costar 3370
Cotton gauze Fisherbrand 13-761-52 Used for blood draw
Crystal violet Acros Organic 40583-0250
Culture tubes Fisherbrand 14-961-27 Borosilicate Glass 13 x 100 mm
D-(+)-glucose Sigma G-8270
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392-250G Used for isolation of neutrophils
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x Gibco 14190-144
Ethidium homodimer-1 Invitrogen L3224 B
Ficoll-Paque plus Cytiva 17144003 Used for isolation of neutrophils (density gradient medium)
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x Corning cellgro 21-022-CV without calcium, magnesium, and phenol red
Hemacytometer Bright Line
Heparin Novaplus NDC 63323-540-57 1000 USP units/mL, Used for blood draw
IMARIS 9.8 Oxford Instruments Microscopy image analysis software
Luminol Sigma A8511-5G
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x Gibco 41061-029
Needle (23 G1) BD 305145 Used for blood draw
Nikon Eclipse Ti2 Nikon
NIS-Elements Nikon Quantification of dead neutrophils
Normal human serum Complement Technology NHS
Petri Dish (100 x 15 mm) VWR 25384-342
Phorbol 12-myristate 13-acetate
Poly-L-lysine solution Sigma P4707-50ML
Sodium chloride Fisher Bioreagents BP358-10 Used for neutrophil isolation
SoftMax Pro Software Molecular Devices Microplate reader software used for data acquisition
SpectraMax i3x Molecular Devices Microplate reader
Sterile water for irrigation, USP Baxter 2F7114 Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation
Surflo winged infusion set Terumo SC*19BLK 19 G x 3/4", used for blood draw
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Turnicate Used for blood draw
UltraPure distilled water Invitrogen 10977015
White opaque 96-well plates Falcon 353296 Tissue culture treated and flat bottom plate
μ-Slide VI 0.4 Ibidi 80601 μ-channel slide
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
  2. Alhede, M., et al. Phenotypes of non-attached Pseudomonas aeruginosa aggregates resemble surface attached biofilm. PLoS One. 6 (11), 27943 (2011).
  3. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews: Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
  4. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
  5. Schilcher, K., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm development: structure, regulation, and treatment strategies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (3), 0002 (2020).
  6. Kaplan, J. B. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. Journal of Dental Research. 89 (3), 205-218 (2010).
  7. Otto, M. Staphylococcal Biofilms. Microbiology Spectrum. 6 (4), 10 (2018).
  8. Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus biofilm: a complex developmental organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
  9. Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infection and Immunity. 69 (5), 3423-3426 (2001).
  10. Zheng, Y., He, L., Asiamah, T. K., Otto, M. Colonization of medical devices by staphylococci. Environmental Microbiology. 20 (9), 3141-3153 (2018).
  11. Donlan, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerging Infectious Diseases. 7 (2), 277-281 (2001).
  12. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  13. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  14. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  15. van Kessel, K. P., Bestebroer, J., van Strijp, J. A. Neutrophil-mediated phagocytosis of Staphylococcus aureus. Frontiers in Immunology. 5, 467 (2014).
  16. Nguyen, G. T., Green, E. R., Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mechanisms of NADPH oxidase activation and bacterial resistance. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 373 (2017).
  17. Saini, R., Singh, S. Inducible nitric oxide synthase: An asset to neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 105 (1), 49-61 (2019).
  18. Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
  19. Segal, A. W. The function of the NADPH oxidase of phagocytes and its relationship to other NOXs in plants, invertebrates, and mammals. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (4), 604-618 (2008).
  20. Fang, F. C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies. Nature Reviews Microbiology. 2 (10), 820-832 (2004).
  21. Bogdan, C. Nitric oxide and the immune response. Nature Immunology. 2 (10), 907-916 (2001).
  22. Chua, S. L., et al. Reactive oxygen species drive evolution of pro-biofilm variants in pathogens by modulating cyclic-di-GMP levels. Open Biology. 6 (11), 160162 (2016).
  23. El Haj, C., Lichtenberg, M., Nielsen, K. L., Bjarnsholt, T., Jensen, P. O. Catalase protects biofilm of Staphylococcus aureus against daptomycin activity. Antibiotics. 10 (5), 511 (2021).
  24. Ghimire, N., et al. Direct microscopic observation of human neutrophil-Staphylococcus aureus interaction in vitro suggests a potential mechanism for initiation of biofilm infection on an implanted medical device. Infection and Immunity. 87 (12), 00745 (2019).
  25. Bhattacharya, M., et al. Leukocidins and the nuclease nuc prevent neutrophil-mediated killing of Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 88 (10), 00372 (2020).
  26. Bogachev, M. I., et al. Fast and simple tool for the quantification of biofilm-embedded cells sub-populations from fluorescent microscopic images. PLoS One. 13 (5), 0193267 (2018).
  27. Kerstens, M., et al. A flow cytometric approach to quantify biofilms. Folia Microbiologica. 60 (4), 335-342 (2015).
  28. Meyle, E., et al. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation. The International Journal of Artificial Organs. 33 (9), 608-620 (2010).
  29. Oveisi, M., et al. Novel assay to characterize neutrophil responses to oral biofilms. Infection and Immunity. 87 (2), 00790 (2019).
  30. Leid, J. G., Shirtliff, M. E., Costerton, J. W., Stoodley, P. Human leukocytes adhere to, penetrate, and respond to Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 70 (11), 6339-6345 (2002).
  31. Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), 00537 (2013).
  32. Cody, W. L., et al. Skim milk enhances the preservation of thawed -80 degrees C bacterial stocks. Journal of Microbiological Methods. 75 (1), 135-138 (2008).
  33. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, 3064 (2012).
  34. Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L., Fernandes, E. Optimization of experimental settings for the analysis of human neutrophils oxidative burst in vitro. Talanta. 78 (4-5), 1476-1483 (2009).
  35. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
  36. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
  37. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  38. Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunology Research. 2017, 1254792 (2017).
  39. Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
  40. Staats, A., et al. Rapid aggregation of Staphylococcus aureus in synovial fluid is influenced by synovial fluid concentration, viscosity, and fluid dynamics, with evidence of polymer bridging. mBio. , 0023622 (2022).
  41. Chiu, I. M., et al. Bacteria activate sensory neurons that modulate pain and inflammation. Nature. 501 (7465), 52-57 (2013).
  42. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. 102 (1), 14-15 (2013).
  43. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  44. Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
  45. Luo, T. L., et al. Introducing BAIT (Biofilm Architecture Inference Tool): a software program to evaluate the architecture of oral multi-species biofilms. Microbiology. 165 (5), 527-537 (2019).
  46. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. Journal of Applied Microbiology. 105 (2), 585-590 (2008).
  47. Eze, E. C., El Zowalaty, M. E. Combined effects of low incubation temperature, minimal growth medium, and low hydrodynamics optimize Acinetobacter baumannii biofilm formation. Infection and Drug Resistance. 12, 3523-3536 (2019).
  48. Harris, L. G., Tosatti, S., Wieland, M., Textor, M., Richards, R. G. Staphylococcus aureus adhesion to titanium oxide surfaces coated with non-functionalized and peptide-functionalized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) copolymers. Biomaterials. 25 (18), 4135-4148 (2004).
  49. Miao, J., et al. Biofilm formation of Staphylococcus aureus under food heat processing conditions: first report on cml production within biofilm. Scientific Reports. 9 (1), 1312 (2019).
  50. Lade, H., et al. Biofilm formation by Staphylococcus aureus clinical isolates is differentially affected by glucose and sodium chloride supplemented culture media. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1853 (2019).
  51. Guzel Kaya, G., et al. Antibacterial activity of linezolid against gram-negative bacteria: utilization of epsilon-Poly-l-Lysine capped silica xerogel as an activating carrier. Pharmaceutics. 12 (11), 1126 (2020).
  52. Clinton, A., Carter, T. Chronic wound biofilms: pathogenesis and potential therapies. Laboratory Medicine. 46 (4), 277-284 (2015).
  53. Scheel-Toellner, D., et al. Reactive oxygen species limit neutrophil life span by activating death receptor signaling. Blood. 104 (8), 2557-2564 (2004).
  54. Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006842 (2018).
  55. Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1005-1010 (2016).
  56. Suo, Y., Huang, Y., Liu, Y., Shi, C., Shi, X. The expression of superoxide dismutase (SOD) and a putative ABC transporter permease is inversely correlated during biofilm formation in Listeria monocytogenes 4b G. PLoS One. 7 (10), 48467 (2012).
  57. Olwal, C. O., Ang’ienda, P. O., Ochiel, D. O. Alternative sigma factor B (sigma(B)) and catalase enzyme contribute to Staphylococcus epidermidis biofilm’s tolerance against physico-chemical disinfection. Scientific Reports. 9 (1), 5355 (2019).
  58. Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
  59. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  60. Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
  61. Pletzer, D., Mansour, S. C., Wuerth, K., Rahanjam, N., Hancock, R. E. New mouse model for chronic infections by gram-negative bacteria enabling the study of anti-infective efficacy and host-microbe interactions. mBio. 8 (1), 00140 (2017).
  62. Davis, M. M. A prescription for human immunology. Immunity. 29 (6), 835-838 (2008).
  63. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).

Tags

NeutrophilsStaphylococcus AureusBiofilmsIn Vitro AssaysOpsonizationLuminolSerumPLLMEM-alphaHBSSBiofilm FormationBiofilm QuantificationStandardized Protocols

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rana, P. S. J. B., Gloag, E. S., Wozniak, D. J. Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms. J. Vis. Exp. (184), e63773, doi:10.3791/63773 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image