ヒト好中球と黄色ブドウ球菌バイオフィルムの間の相互作用を視覚化および定量するための標準化されたin vitroアッセイ

すべての手順は、オハイオ州立大学治験審査委員会(IRB)(2014H0154)によって承認されました。初代ヒト好中球を単離するために末梢血を採取するためのインフォームド・書面による同意がすべてのドナーから得られた。 黄色ブドウ球 菌(USA300 LAC)31 を実験を行うためのモデル生物として使用しました。実験は、血液媒介病原体への潜在的な曝露のために、適切な個人用保護具(PPE)を使用して実施されました。 1. in vitro バイオフィルムの調製 トリプシン大豆寒天培地などの栄養豊富な寒天プレート上のストリークプレート技術32,33を用いて凍結保存ストック31から黄色ブドウ球菌の単離されたコロニーを得る(材料の表を参照)。 滅菌H2Oで希釈した0.001%(v/v)ポリ-L-リジン(PLL)100 μLで96ウェルプレートの個々のウェルをコーティングし、室温で30分間インキュベートします。無菌的に、真空アシスト吸引トラップを使用してPLL溶液を吸引します。ウェルを室温で一晩乾燥させます。注意: プロトコルのすべての吸引ステップは、特に明記されていない限り、真空支援吸引トラップを使用して実行されます。 黄色 ブドウ球 菌のコロニーに2%グルコースを添加した最小必須培地α(MEMα)に接種して一晩培養を準備し、37°Cでインキュベートし、200rpmで16〜18時間振とうします。 2%グルコースを添加した5 mLの新鮮なMEMαに50 μLを移して一晩培養液を希釈し、37°Cで200 rpmで振とうし、対数期半ばまで、一般に光学密度600(OD600nm)が0.5〜0.8になるまでインキュベートします。MEMαを使用して、中対数培養をOD600nm の0.1に正規化します。 150 μLの正規化培養液をPLL処理96ウェルプレートの各ウェルに移します。37°Cの加湿チャンバーで18〜20時間静置インキュベートします。注:バイオフィルムは、μチャンネルスライドなどの他の形式で成長させることもできます(材料表を参照)。 上清を吸引して浮遊細胞を除去する。残りのバイオマスを150 μLのハンクスバランスソルトソルト溶液(HBSS)で穏やかに洗浄し、付着していない細胞を取り除きます。バイオフィルムの乱れを避けるためにHBSSを滴下します。注:洗浄中に上清とHBSSを吸引している間は、バイオフィルムがまだ浸っているように、バイオフィルムを含むウェルに十分な液体(上清またはHBSS)を残してください。これにより、HBSSを滴下してバイオフィルムを洗浄する際のバイオフィルム構造の破壊を防止します。 手順 1.6 を少なくとも 2 回繰り返して、すべてのプランクトン細胞を削除します。この時点で、バイオフィルムはすぐに下流の実験の準備ができています。注:バイオフィルムを好中球実験に使用しない場合は、HBSSをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に置き換えることができます。HBSSは、好中球活性化のための最適条件を提供するグルコースを含む成分を含むので、PBSよりも好ましい34。 2. バイオフィルムバイオマスの定量化 20%(v / v)エタノールと80%(v / v)H 2 Oに溶解することにより、0.1%(w / v)クリスタルバイオレット(CV)溶液(材料の表を参照)のストックを準備します。 H2Oを添加する前に、CVがエタノールに完全に溶解していることを確認してください。 溶液をフィルター滅菌します。 洗浄したバイオフィルムに150 μLの0.1%CV溶液を加え、室温で20分間インキュベートします。少なくとも 3 つの空のウェルをメディアのみのコントロールとして使用します。 バイオフィルムから0.1%CV溶液を吸引し、染色したバイオフィルムを200 μLの1x PBSで洗浄します。このプロセスを合計3回の洗浄で繰り返し、ウェルから余分なCVを除去します。 H2Oで希釈した33%(v/v)氷酢酸150 μLを加え、ロッカー上で室温で50 rpmで30分間インキュベートし、バイオマスに結合したCVを完全に溶解させます。注意: 氷酢酸は腐食性の化学物質であるため、適切なPPEを使用した層流フードでこの手順を実行してください。 それまでの間、マイクロプレートリーダー( 材料表を参照)をセットアップして、CV染色値を読み取ってください。氷酢酸処理後、595nmの波長でプレートを読み取ります。注:CVのODを測定するために使用される波長は、500〜600nm35の範囲である可能性があります。 3.好中球の分離 注:好中球は、以前に発表された方法に従って分離され、わずかな変更がありました36。この分離プロトコルは、最初に密度勾配遠心分離、次に3%デキストラン沈降を組み合わせたものです。このセクションでは、公開されたプロトコルに加えられた変更に焦点を当てて、好中球分離プロトコル全体についてのみ説明します。さらに、以下に概説するプロトコルは、好中球を単離することができる多くの方法の1つであり、必要に応じて置換することができる。好中球を単離するための他の方法には、細胞分離培地または磁気抗体細胞分離の使用が含まれる37。 施設のIRBで概説されているプロトコルに従って、静脈穿刺 を介して 成人ドナーから採血します。採血の前に、ヘパリンの最終濃度が20 U / mLになるように、シリンジに十分な防腐剤を含まないヘパリンが含まれていることを確認してください。 ヘパリン化血液を室温でH2O中のエンドトキシンフリー0.9%NaCl(材料の表を参照)の3/4の容量で希釈する。 希釈した血液サンプル20 mLごとに、市販の密度勾配培地( 材料の表を参照)を新鮮な50 mLコニカルチューブに14 mL分注します。希釈した血液サンプルを密度勾配培地の上に慎重に重ねます。 層状血液サンプルを400 x g で室温で40分間遠心分離します。遠心分離が完了した後に層を乱さないように、遠心分離機のブレークが遅いことを確認してください。注:血液サンプルには、生理食塩水と血漿の混合物、単核細胞層、密度勾配培地、好中球、赤血球を含む5つの層があります。 血清学的ピペットを用いて、好中球および赤血球ペレットの上方のすべての層を吸引し、続いて、H2O中の冷たいエンドトキシンフリー0.9%NaCl中のペレットの穏やかな再懸濁を行った。20 mLの血液サンプルから生成された各ペレットについて、ペレットを合計20 mLの容量に再懸濁します。3%デキストランの1:1体積を追加します( 材料表を参照)。チューブを氷上で18〜20分間直立させます。注:3%デキストランがH2O中のエンドトキシンフリー0.9%NaClで作られていることを確認してください。 好中球と赤血球を含む上層20 mLを新しい50 mLコニカルチューブに移し、355 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 赤いペレットを残して上清を注ぎます。 ペレットを10 mLの冷たく滅菌したH2Oに30秒間静かに再懸濁して、残りの赤血球を溶解します。すぐに10 mLの冷たいエンドトキシンフリーの0.9%生理食塩水を混合物に加えて、張度を回復させます。溶液を233 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 上清を注ぎ、血液サンプル20 mLあたり1 mLの冷たいHBSSに95%〜97%の好中球を含むペレットを再懸濁します。 再懸濁した好中球10 μLを90 μLの0.4%トリパンブルー排除色素に移し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします(材料の表を参照)。注:トリパンブルー排除色素は生細胞では不透過性であるため、非生存細胞は青色に染色されます。このプロトコルは、>99%の細胞生存率を提供する37,38。 好中球の最終濃度が4 x 106 細胞/ mLになるようにHBSSを追加します。注:細胞生存率が<99%の場合、4 x 106 細胞/ mLの最終濃度を達成できます。ただし、得られる4 x 106 細胞/ mLを含む溶液の総量は減少します。好中球の最終濃度は、ユーザーの実験ニーズに応じて調整することができます。好中球は、以下に説明するすべての実験について、4 x 106 細胞/ mLの最終濃度で再懸濁されました。ドナー間のばらつきを説明するために、好中球に関連するすべての実験は、少なくとも3つの異なるドナーで実行することを強くお勧めします。 4. 好中球が産生するROSの測定 洗浄したバイオフィルムに100 μLの20%正常ヒト血清(HBSSで希釈)を滴下し(ステップ1.6)、静置条件下で37°Cで30分間インキュベートしてバイオフィルムをオプソニン化します。 20%血清溶液を吸引し、バイオフィルムを150μLのHBSSで1回滴下して洗浄します。HBSSを吸引し、オプソニン化されたバイオフィルムを含むウェルを残します。注:実験の解釈のために、最低4つのグループが推奨されます:(A)好中球+バイオフィルム、(B)好中球+ PMA(ポジティブコントロール、 材料の表を参照)、(C)好中球のみ、および(D)バイオフィルムのみ。 HBSSに再懸濁した好中球にルミノール( 材料の表を参照)を4 x 106 細胞/mLの濃度で加え、最終的なルミノール濃度が50 μMになるようにします。このソリューションは、グループ (A) と (C) にすぐに使用できます。ルミノールと混合した4 x 105 好中球をオプソニン化バイオフィルムを含むウェルに加える。 別のチューブで、好中球を含まないHBSS中の50 μMルミノール溶液を調製し、バイオフィルムを含むウェル(グループD)に加えます。 350 μLの好中球をルミノールと混合し、ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)を最終濃度500 ng/mLで混合物に加えます。グループ(B)の場合、この混合物から4 x 105 好中球をバイオフィルムのないウェルに追加します。これはポジティブコントロールとして機能します。注:このステップで示されるPMAの濃度は、PMA刺激好中球がポジティブコントロールであるため、堅牢なバースト応答を確保するために比較的高くなっています。PMAは、実験に応じて、好中球を活性化するために低濃度で使用できます。 プレートを270 x g で4°Cで30秒間遠心分離します。 プレートリーダーが37°Cに設定され、発光とキネティックリードの設定が3分間隔で60分間設定されていることを確認します。プレートをプレートリーダーに入れて、好中球によるROS産生を60分間測定します。注:このアッセイでは、発光アッセイに使用される白色プレートでバイオフィルムを成長させました。PMAは、酸化的バースト応答39の既知のアゴニストである。PMAを含む研究を実施する場合、PMAはすぐにバースト応答を開始するため、好中球を含む溶液が冷たくなっている間に、最終ステップでPMAが追加されていることを確認してください。 5. バイオフィルム-好中球相互作用のイメージング 手順1.2〜1.6を使用してバイオフィルムを設定します。バイオフィルムイメージングを容易にするために、緑色蛍光タンパク質(GFP)40,41を発現するUSA300などの黄色ブドウ球菌の蛍光株を採用して、顕微鏡イメージングの容易さを高めます。注:in vitroバイオフィルムモデルを実証するために、96ウェルプレートの代わりに6 μチャンネルスライド(材料の表を参照)を使用しました(ステップ1)。 4 x 106 細胞/mLの好中球を100 μMのBlue CMAC(7-アミノ-4-クロロメチルクマリン)色素(BCD、 材料表を参照)とともに、37°Cおよび5%CO2のロッカーで30分間インキュベートします。サンプルが暗闇でインキュベートされていることを確認し、残りのステップでは光への露出を制限します。 余分なBCDを洗浄するには、好中球を270 x g で5分間遠心分離し、上清を吸引します。好中球を新鮮なHBSSに再懸濁します。この時点で、エチジウムホモ二量体-1( 材料の表を参照)をBCD染色好中球に最終濃度4 μMで添加して、好中球と細菌の死を監視します。 μスライドで成長させた 黄色ブドウ球菌 バイオフィルムに150 μLの好中球を追加し、好中球と細菌の比率が1:30(好中球:細菌)になるようにします。μスライドを加湿チャンバーで30分間インキュベートします。細菌細胞の数は、18時間のバイオフィルムをめっきして得られた細胞数に基づいています。 蛍光色素/タンパク質の励起波長と発光波長に対応する蛍光チャネルを使用して、好中球とバイオフィルムの相互作用を画像化します。注:本研究では、BCDは353/466 nm、エチジウムホモ二量体-1は528/617 nm、GFPは395/509 nmです。サンプルの光退色を防ぐために、サンプルのレーザーまたは光への曝露を制限します。 顕微鏡画像解析ソフトウェアまたはFIJI / ImageJ、COMSTAT2、BiofilmQ、BAITなどのプログラムを使用して画像を分析します42,43,44,45。注意: 汚れを扱うときは、使用する染料の特異性を考慮することが重要です。一部の染色は原核細胞と真核細胞に作用しますが、他の染色剤は1つにのみ作用します。好中球とバイオフィルムを両方の細胞タイプを染色できる色素を使用して別々に染色する場合は、クロス染色を防ぐために、好中球とバイオフィルムを組み合わせる前に、残っている色素を必ず洗い流してください。