Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu
Summary
Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Sitoiskelet filamentlerinin ve bunlarla ilişkili proteinlerin doğrudan görselleştirilmesi için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Toplam iç-yansıma-floresan (TIRF) mikroskopisi yüksek bir sinyal-arka plan oranına sahiptir, ancak floresan proteinlerinin fotobeyazlatma ve fotohasarından muzdariptir. Girişim yansıma mikroskobu (IRM) ve interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT) gibi etiketsiz teknikler, fotobeyazlatma problemini ortadan kaldırır, ancak tek molekülleri kolayca görselleştiremez. Bu yazıda, mikrotübülle ilişkili proteinlerin (MAP’ler) ve dinamik mikrotübüllerin in vitro olarak görüntülenmesi için IRM’yi ticari bir TIRF mikroskobu ile birleştirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, dinamik mikrotübüllerle etkileşime giren MAP’lerin yüksek hızda gözlemlenmesini sağlar. Bu, hem mikrotübül etiketleme ihtiyacını hem de ikinci bir uyarma lazeri gibi birkaç ek optik bileşene olan ihtiyacı ortadan kaldırarak mevcut iki renkli TIRF kurulumlarını geliştirir. Görüntü kaydı ve kare senkronizasyonu sorunlarını önlemek için her iki kanal da aynı kamera yongasında görüntülenir. Bu kurulum, dinamik mikrotübüller üzerinde yürüyen tek kinesin moleküllerini görselleştirerek gösterilmiştir.
Introduction
Toplam-iç-yansıma-floresan (TIRF) mikroskopisi, tek floresan moleküllerinin görselleştirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Epifloresan görüntüleme ile karşılaştırıldığında, TIRF üstün arka plan bastırma elde ederek yüksek çözünürlüklü lokalizasyona ve tek floroforların izlenmesine olanak tanır. Bu nedenle, TIRF, floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinleri görselleştirmek için tercih edilen yöntemdir ve mikrotübülleri 1,2 görüntülemek için sıklıkla kullanılır.
Mikrotübül dinamiklerinin MAP’ler tarafından düzenlenmesini araştırmak için, genellikle hem mikrotübülleri hem de MAP’leri aynı anda görüntülemek gerekir. Bu amaç için mevcut yöntemlerin çoğu pahalıdır veya teknik dezavantajlardan muzdariptir. Örneğin, eşzamanlı iki renkli TIRF, iki uyarma lazeri ve iki kamera gerektirir. Yüksek maliyete ek olarak, ayrı kameralara duyulan ihtiyaç, kare senkronizasyonu ve görüntü kaydı sorunlarına neden olmaktadır. Ardışık çerçevelerde uyarma lazerleri arasında fiziksel olarak geçiş yapmak için dönen bir filtre küpü kullanılırsa bu ihtiyaç aşılabilir3. Böyle bir kurulumda, tek bir kamera çipi kullanılabilir ve çerçeveler mikrotübüllerin ve MAP’lerin görüntüleri arasında geçiş yapar. Ancak bu teknik, genellikle kare hızını saniyede 0,5 karenin3 (fps) altından daha azıyla sınırlayan filtre değişiminin hızıyla sınırlıdır. Böyle bir kare hızı, 500 nm / s’ye kadar bir hızda meydana gelen bir mikrotübülün büzülmesi, bir kinezinin 800 nm / s mertebesinde bir hızda yürümesi veya 0,3 μm2 / s4’ü aşan difüzyon katsayılarıyla meydana gelen bir MAP’nin difüzyonu gibi hızlı dinamik süreçleri çözmek için yetersizdir. Bu, her kanaldaki iki hareketli hedefin göreceli konumlarını izlerken özellikle sorunludur, örneğin hareketli bir mikrotübül ucu5’in konumuna göre bir MAP’nin konumu.
Bu optik kısıtlamalara ek olarak, iki renkli TIRF mikroskopisi, MAP’lerin ve mikrotübüllerin, emisyon spektrumları yeterince ayrılmış farklı floroforlarla etiketlenmesini gerektirir. Tübülinin floresan etiketlemesi mikrotübül dinamiklerini değiştirebilir6 ve floroforların fotobeyazlatılması görüntüleme hızınısınırlar 7. Bu sorunlar nedeniyle, mikrotübülleri görselleştirmek için etiketsiz görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT)8,9, döner-tutarlı-saçılma mikroskobu (ROCS)10, uzamsal ışık girişim mikroskobu (SLIM)11 ve girişim yansıma mikroskobu (IRM)12,13 bulunur. Bu teknikler, floresan görüntülemenin dezavantajları olmadan mikrotübüllerin etiketsiz hızlı görüntülenmesini sağlar, ancak tek MAP’leri görselleştirmek için kullanılamazlar.
Bu etiketsiz tekniklerden IRM, düşük maliyeti ve enstrümantasyondaki mütevazı talepleri ile öne çıkıyor. Yakın zamanda IRM’yi ticari bir TIRF mikroskobu ile birleştirmek için mikrotübüllerin ve floresan MAP’lerin alternatif çerçevelerde görüntülenmesini sağlayanbir protokol sunduk 3,13. Bu belgede, TIRF ve IRM görüntülerini aynı anda tek bir kamera yongasında yakalamak için bu kurulumu değiştirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu, numuneyi aynı anda bir TIRF lazer ve bir IRM LED ışık kaynağı ile aydınlatmak için uyarma yoluna ucuz bir ışın ayırıcının eklenmesini içerir. Modifiye edilmiş bir ticari görüntü ayırıcı, TIRF ve IRM sinyallerini spektral olarak ayırmak ve bunları aynı kamera çipinin ayrı yarılarına yansıtmak için kullanılır. Ayrıca, görüntüleme sırasında reaktiflerin hızlı bir şekilde değiştirilmesini sağlayan bir mikroakışkan sistem kullanıyoruz. Bu protokol, bu kurulumun dinamik mikrotübülleri ve MAP’leri görüntülemek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Aparatın kapasitesi, 10 s-1 kare hızında yakalanan küçülen mikrotübüller üzerinde yürüyen kinesin-1 proteinlerinin ilk görselleştirmesi sunularak gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrotübül dinamiklerinin mikrotübülle ilişkili proteinler (MAP’ler) tarafından düzenlenmesini incelemek genellikle mikrotübüllerin ve MAP’lerin eşzamanlı görüntülenmesini gerektirir. TIRF gibi floresan mikroskopi teknikleri tipik olarak bu amaçla kullanılır. Bununla birlikte, fotobeyazlatma, fotohasar ve florofor etiketleme ihtiyacını içeren floresan görüntülemenin dezavantajları ile sınırlıdırlar. IRM gibi etiketsiz yöntemler, mikrotübülleri görselleştirmek için uygundur, ancak tek floroforları görüntüleyemez. Bu protokol, dinamik mikrotübüllerin ve MAP’lerin eşzamanlı görüntülenmesi için etiketsiz IRM görüntüleme ve TIRF mikroskopisini birleştirir.
IRM kurulumu, >600 nm’ye filtrelenmiş bir LED aydınlatma kaynağı kullanırken, TIRF kurulumu 488 nm lazer kullanır. Aydınlatma ışığını numuneye yansıtmak ve toplanan sinyali dedektöre iletmek için ucuz bir plaka ışın ayırıcı kullandık (Şekil 1). Tek moleküllü sinyal kaybını en aza indirmek için% 10 yansıtma ve% 90 iletim ile bir ışın ayırıcı seçildi. Aydınlatma ışık yoğunluğundaki% 90’lık kayıp, aydınlatma lazerinin ve LED’in gücünü artırarak telafi edilir.
Sinyallerin spektral ayrımı, bir 90/10 (R / T) ışın ayırıcı ve iki spektral filtre (IRM için uzun geçişli 600 nm ve TIRF için bant geçişli 535/50 nm) kullanılarak elde edildi. Spektral olarak ayrılmış IRM ve TIRF sinyalleri, bir görüntü ayırıcı tertibatı kullanılarak tek bir kamera çipinin iki yarısına yansıtılır. 90/10 ışın ayırıcının kullanılması, IRM sinyalinin% 90’ını feda eder, ancak bu, LED aydınlatma kaynağının yoğunluğunu artırarak telafi edilir. IRM ve TIRF sinyallerini daha verimli bir şekilde ayırmak için burada dikroik bir ayna da kullanılabilir. Tahlillerde yer alan floresan mikroboncuklar, TIRF ve IRM görüntülerinin doğru bir şekilde hizalanmasını sağlar ve hedefe odaklanmak için bir referans görevi görür.
Bu protokoldeki en kritik optik eleman, yüksek sayısal açıklık (NA) hedefidir. Bu sadece toplam iç yansıma elde etmek için değil, aynı zamanda koleksiyon verimliliğini ve görüntü kontrastını en üst düzeye çıkarmak için de gereklidir. Elde edilen görüntülerin kalitesi aynı zamanda cam yüzeyin temizliğine ve düzgün olmayan aydınlatmayı düzeltmek ve statik özellikleri kaldırmak için net bir arka plan görüntüsünün elde edilmesine de bağlıdır. IRM görüntüleme için, mikrotübüllerin ve proteinlerin fotohasarını en aza indirmek için uzun dalga boyu aydınlatması (>600 nm) kullanmanızı öneririz. Bu özellikle beyaz bir LED ışık kaynağı kullanılıyorsa önemlidir, bu durumda herhangi bir UV ışığını gidermek için uzun geçirgen bir filtre dahil edilmelidir.
Bu protokol, dinamik mikrotübüllerin etiketsiz, yüksek hızlı görüntülenmesini ve floresan MAP’lerin eşzamanlı yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar17. Mikrotübüllerin ve MAP’lerin görüntülerini yakalamak arasında geçiş yapan filtre küpü anahtarlama tekniğiyle karşılaştırıldığında, bu kurulum bir filtre küpünün fiziksel dönüşüne bağlı olmadığından çok daha yüksek kare hızlarına sahiptir. İki renkli TIRF görüntüleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu teknik daha az zorlu bir optik kurulum kullanır ve mikrotübüllerin florofor etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu kurulumun birincil sınırlamaları, MAP’lerin TIRF görüntülemesinden kaynaklanmaktadır; kare hızı bir floroforun pozlama süresi ile sınırlıdır ve floroforların fotobeyazlatılması bir olasılık olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, bu protokol mevcut teknikleri geliştirir, çünkü TIRF’yi yalnızca gerektiğinde kullanır (yani, MAP’leri görselleştirmek için ancak mikrotübülleri görselleştirmek için) ve TIRF sınırları içinde mümkün olan en yüksek hıza ulaşır. Daha fazla iyileştirme ancak hem mikrotübüller hem de MAP’ler interferometrik bir teknikle görselleştirilirse mümkündür, ancak bu, MAP’lerin sınırlamaları ve deneysel zorlukları olan metal nanopartiküllerle etiketlenmesini gerektirir.
Bu tekniğin yeteneklerini göstermek için, IRM ve TIRF aracılığıyla iki hızlı dinamik süreci aynı anda görselleştirdik: bir mikrotübülün büzülmesi ve bir floresan kinesin molekülünün yürümesi. Bu teknik daha önce spastinin küçülen mikrotübüller üzerindeki hızlı difüzyonunu görselleştirmek için kullanılmıştır5. MAP’lere ve mikrotübüllere yapılan bu uygulamanın ötesinde, bu protokol, tek floresan molekülleri, bir hücre zarı veya aktin filamenti gibi IRM aracılığıyla görselleştirilebilecek kadar büyük herhangi bir makromoleküler yapı ile aynı anda görselleştirmek için kullanılabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thierry Emonet’in laboratuvarına temiz oda ekipmanlarını paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu çalışmada kullanılan saflaştırılmış eGFP-kinezini hazırladığı için Yin-Wei Kuo’ya teşekkür ederiz. YT, Alexander von Humboldt Vakfı’nın Feodor Lynen Araştırma Bursu aracılığıyla desteğini kabul eder. Bu çalışma NIH Grant R01 GM139337 (J.H.’ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -. W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -. W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V., Astratov, V. . Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. , 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy). Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. Microfabrication in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
