השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים
Summary
אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.
Abstract
מספר טכניקות שימשו להדמיה ישירה של חוטי שלד ציטוסקטליים והחלבונים הקשורים אליהם. למיקרוסקופיה פלואורסצנטית כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית (TIRF) יש יחס אות-לרקע גבוה, אך היא סובלת מ-photo-הלבנה ופוטו-דאמג’ים של החלבונים הפלואורסצנטיים. טכניקות נטולות תוויות כגון מיקרוסקופיית השתקפות הפרעות (IRM) ומיקרוסקופיית פיזור אינטרפרומטרית (iSCAT) עוקפות את בעיית הפוטו-הלבנה, אך אינן יכולות לדמיין בקלות מולקולות בודדות. מאמר זה מציג פרוטוקול לשילוב IRM עם מיקרוסקופ TIRF מסחרי להדמיה סימולטנית של חלבונים הקשורים למיקרוטובולים (MAPs) ומיקרוטובולים דינמיים במבחנה. פרוטוקול זה מאפשר תצפית במהירות גבוהה על MAPs המקיימים אינטראקציה עם מיקרוטובולים דינמיים. זה משפר את הגדרות ה-TIRF הקיימות בשני צבעים על ידי ביטול הצורך בתיוג מיקרו-טובולים והצורך במספר רכיבים אופטיים נוספים, כגון לייזר עירור שני. שני הערוצים מצולמים על אותו שבב מצלמה כדי למנוע רישום תמונה ובעיות סנכרון מסגרת. הגדרה זו מודגמת על ידי הדמיה של מולקולות קינזין בודדות ההולכות על מיקרוטובולים דינמיים.
Introduction
מיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית (TIRF) משמשת בדרך כלל להדמיה של מולקולות פלואורסצנטיות בודדות. בהשוואה להדמיית אפיפלואורסצנציה, TIRF משיג דיכוי רקע מעולה, המאפשר לוקליזציה ברזולוציה גבוהה ומעקב אחר פלואורופורים בודדים. מסיבה זו, TIRF היא השיטה המועדפת להדמיה של חלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי, והיא משמשת לעתים קרובות לצילום מיקרוטובולים 1,2.
כדי לחקור את הרגולציה של דינמיקת מיקרוטובולים על ידי MAPs, לעתים קרובות יש צורך לדמות הן microtubules והן MAPs בו זמנית. רוב השיטות הקיימות למטרה זו הן יקרות או סובלות מחסרונות טכניים. TIRF דו-צבעי סימולטני, למשל, דורש שני לייזרי עירור ושתי מצלמות. בנוסף לעלות הגבוהה, הצורך במצלמות נפרדות מציב בעיות של סנכרון פריימים ורישום תמונות. ניתן לעקוף צורך זה אם קוביית מסנן מסתובבת משמשת למעבר פיזי בין לייזרי עירור במסגרותעוקבות 3. בהתקנה כזו, ניתן להשתמש בשבב מצלמה יחיד, והמסגרות מתחלפות בין תמונות של מיקרוטובולים ו- MAPs. עם זאת, טכניקה זו מוגבלת על ידי מהירות שינוי המסנן, שבדרך כלל מגבילה את קצב הפריימים לפחות מ-0.5 פריימים לשנייה3 (fps). קצב פריימים כזה אינו מספיק כדי לפתור תהליכים דינמיים מהירים, כגון התכווצות של מיקרוטובול המתרחש במהירות של עד 500 ננומטר לשנייה, הליכה של קינזין במהירות בסדר גודל של 800 ננומטר לשנייה, או דיפוזיה של MAP המתרחשת עם מקדמי דיפוזיה העולים על 0.3 μm2/s4. זה בעייתי במיוחד כאשר עוקבים אחר המיקומים היחסיים של שתי מטרות נעות בכל ערוץ, כגון מיקום של MAP ביחס למיקום של קצה מיקרוטובול נע5.
בנוסף לאילוצים אופטיים אלה, מיקרוסקופיית TIRF בשני צבעים דורשת ש-MAPs ומיקרוטובולים יתויגו בפלואורופורים שונים שספקטרום הפליטה שלהם מופרד במידה מספקת. תיוג פלואורסצנטי של טובולין יכול לשנות אתהדינמיקה של המיקרוטובולים 6, והלבנת הפוטו של פלואורופורים מגבילה את מהירות ההדמיה7. בגלל בעיות אלה, פותחו טכניקות הדמיה ללא תוויות כדי להמחיש מיקרו-טובולים. אלה כוללים מיקרוסקופיית פיזור אינטרפרומטרית (iSCAT)8,9, מיקרוסקופיה מסתובבת-קוהרנטית-מתפזרת (ROCS)10, מיקרוסקופיית הפרעות אור מרחבית (SLIM)11, ומיקרוסקופיית השתקפות הפרעות (IRM)12,13. טכניקות אלה מאפשרות הדמיה מהירה ללא תוויות של מיקרוטובולים ללא החסרונות של הדמיה פלואורסצנטית, אך לא ניתן להשתמש בהן כדי להמחיש MAPs בודדים.
מבין הטכניקות נטולות התוויות הללו, IRM בולטת בעלותה הנמוכה ובדרישותיה הצנועות למכשור. לאחרונה הצגנו פרוטוקול לשילוב IRM עם מיקרוסקופ TIRF מסחרי, המאפשר צילום של מיקרוטובולים ו-MAPs פלואורסצנטיים במסגרותמתחלפות 3,13. מאמר זה מציג פרוטוקול לשינוי הגדרה זו כדי לצלם בו-זמנית תמונות TIRF ו-IRM בשבב מצלמה יחיד. זה כולל תוספת של מפצל קרן זול בנתיב העירור כדי להאיר את הדגימה בו זמנית עם לייזר TIRF ומקור אור LED IRM. מפצל תמונה מסחרי שונה משמש להפרדת אותות TIRF ו- IRM באופן ספקטרלי ולהקרנתם על חצאים נפרדים של אותו שבב מצלמה. אנו משתמשים גם במערכת מיקרופלואידית המאפשרת החלפה מהירה של ריאגנטים במהלך ההדמיה. פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בהגדרה זו כדי לצלם מיקרו-טובולים דינמיים ו- MAPs. היכולת של המנגנון מודגמת על ידי הצגת ההדמיה הראשונה של חלבוני קינסין-1 ההולכים על מיקרוטובולים מתכווצים, אשר נלכדים בקצב פריימים של 10 s-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
חקר ויסות הדינמיקה של מיקרוטובולים על ידי חלבונים הקשורים למיקרוטובולים (MAPs) דורש לעתים קרובות הדמיה סימולטנית של מיקרוטובולים ו-MAPs. טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כגון TIRF משמשות בדרך כלל למטרה זו. עם זאת, הם מוגבלים על ידי החסרונות של הדמיה פלואורסצנטית, הכוללים פוטו-אקונומיקה, פוטו-דיאמג’, והצורך בתיוג פלואורופור. שיטות ללא תוויות, כגון IRM, מתאימות להדמיה של מיקרוטובולים אך אינן מסוגלות להדמיית פלואורופורים בודדים. פרוטוקול זה משלב הדמיית IRM ללא תוויות ומיקרוסקופ TIRF להדמיה סימולטנית של מיקרוטובולים דינמיים ו- MAPs.
הגדרת ה-IRM משתמשת במקור תאורת LED המסונן ל->600 ננומטר, בעוד שהגדרת TIRF משתמשת בלייזר של 488 ננומטר. השתמשנו במפצל קרן צלחת זול כדי להחזיר את אור התאורה על הדגימה ולהעביר את האות שנאסף לגלאי (איור 1). מפצל קרן עם 10% רפלקציה ו-90% שידור נבחר כדי למזער את אובדן האות המולקולה הבודדת. ההפסד של 90% בעוצמת אור התאורה מפצה על ידי הגדלת העוצמה של לייזר התאורה והנורית.
ההפרדה הספקטרלית של האותות הושגה באמצעות מפצל קרן 90/10 (R/T) ושני מסננים ספקטרליים (מעבר ארוך של 600 ננומטר עבור IRM ומעבר פס 535/50 ננומטר עבור TIRF). אותות ה-IRM וה-TIRF המופרדים באופן ספקטרלי מוקרנים על שני חצאים של שבב מצלמה יחיד באמצעות מכלול מפצל תמונה. השימוש במפצל קרן 90/10 מקריב 90% מאותות ה-IRM, אך הדבר מפוצה על ידי הגדלת עוצמת מקור תאורת ה-LED. מראה דיכרואית יכולה לשמש כאן גם כדי להפריד את אותות ה-IRM וה-TIRF בצורה יעילה יותר. מיקרובים פלואורסצנטיים הכלולים במבחנים מאפשרים יישור מדויק של תמונות TIRF ו- IRM ומשמשים כהפניה למיקוד המטרה.
האלמנט האופטי הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא מטרת הצמצם המספרי הגבוה (NA). זה חיוני לא רק כדי להשיג השתקפות פנימית כוללת, אלא גם כדי למקסם את יעילות האוסף ואת ניגודיות התמונה. איכות התמונות המתקבלות תלויה גם בניקיון משטח הזכוכית וברכישת תמונת רקע ברורה כדי לתקן תאורה לא אחידה ולהסיר תכונות סטטיות. עבור הדמיית IRM, אנו ממליצים להשתמש בתאורה באורך גל ארוך (>600 ננומטר) כדי למזער את הפוטו-דמה של מיקרוטובולים וחלבונים. זה חשוב במיוחד אם נעשה שימוש במקור אור LED לבן, ובמקרה זה יש לכלול מסנן מעבר ארוך כדי להסיר כל אור UV.
פרוטוקול זה מאפשר הדמיה ללא תוויות במהירות גבוהה של מיקרו-טובולים דינמיים והדמיה סימולטנית ברזולוציה גבוהה של MAPsפלורסנטיים 17. בהשוואה לטכניקת המיתוג של קוביית המסנן, אשר מתחלפת בין לכידת תמונות של מיקרוטובולים ו- MAPs, הגדרה זו מסוגלת לקצבי פריימים גבוהים בהרבה מכיוון שהיא אינה תלויה בסיבוב הפיזי של קוביית מסנן. בהשוואה לטכניקות הדמיה של TIRF בשני צבעים, טכניקה זו משתמשת במערך אופטי תובעני פחות ועוקפת את הצורך בתיוג פלואורופור של מיקרוטובולים. המגבלות העיקריות של הגדרה זו נובעות מהדמיית TIRF של ה- MAPs; קצב הפריימים מוגבל על ידי זמן החשיפה של פלואורופור, והלבנת תמונות של פלואורופורים נותרה אפשרות. עם זאת, פרוטוקול זה משפר את הטכניקות הקיימות מכיוון שהוא משתמש ב- TIRF רק בעת הצורך (כלומר, כדי לדמיין MAPs אך לא מיקרוטובולים) ומשיג את המהירות הגבוהה ביותר האפשרית בגבולות TIRF. שיפורים נוספים אפשריים רק אם גם המיקרו-טובולים וגם ה-MAPs מודגמים באמצעות טכניקה אינטרפרומטרית, אך הדבר דורש תיוג MAPs עם ננו-חלקיקי מתכת, שיש להם מגבלות ואתגרים ניסיוניים.
כדי להדגים את היכולות של טכניקה זו, דמיינו בו זמנית שני תהליכים דינמיים מהירים באמצעות IRM ו- TIRF: התכווצות של מיקרוטובול והליכה של מולקולת קינסין פלואורסצנטית. טכניקה זו שימשה בעבר כדי לדמיין את הדיפוזיה המהירה של ספסטין על מיקרוטובולים מתכווצים5. מעבר ליישום זה על MAPs ומיקרוטובולים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לדמיין מולקולות פלואורסצנטיות בודדות בו זמנית עם כל מבנה מקרומולקולרי מסיבי מספיק כדי שניתן יהיה לדמיין באמצעות IRM, כגון קרום התא או חוט אקטין.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למעבדה של תיירי אמונת על שיתוף ציוד לחדר נקי. אנו מודים ל-Yin-Wei Kuo על הכנת ה-eGFP-kinesin המטוהר ששימש במחקר זה. י.ט. מכיר בתמיכתה של קרן אלכסנדר פון הומבולדט באמצעות מלגת המחקר של פיודור לין. עבודה זו נתמכה על ידי NIH Grant R01 GM139337 (ל- J.H.).
Materials
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -. W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -. W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V., Astratov, V. . Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. , 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy). Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. Microfabrication in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
