Одновременное интерференционное отражение и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения для визуализации динамических микротрубочек и связанных с ними белков
Summary
Представлен протокол реализации интерференционно-отражательной микроскопии и тотальной-внутренней-отражательно-флуоресцентной микроскопии для одновременной визуализации динамических микротрубочек и флуоресцентно меченых микротрубочек-ассоциированных белков.
Abstract
Несколько методов были использованы для прямой визуализации цитоскелетных нитей и связанных с ними белков. Микроскопия тотального внутреннего отражения-флуоресценции (TIRF) имеет высокое отношение сигнала к фону, но она страдает от фотоотбеливания и фотоповреждения флуоресцентных белков. Методы без меток, такие как интерференционная отражательная микроскопия (IRM) и интерферометрическая микроскопия рассеяния (iSCAT), обходят проблему фотоотбеливания, но не могут легко визуализировать отдельные молекулы. В данной работе представлен протокол объединения IRM с коммерческим микроскопом TIRF для одновременной визуализации микротрубочек-ассоциированных белков (MAP) и динамических микротрубочек in vitro. Этот протокол позволяет осуществлять высокоскоростное наблюдение за MAP, взаимодействующими с динамическими микротрубочками. Это улучшает существующие двухцветные установки TIRF, устраняя как необходимость в маркировке микротрубочек, так и необходимость в нескольких дополнительных оптических компонентах, таких как второй лазер возбуждения. Оба канала отображаются на одном чипе камеры, чтобы избежать проблем с регистрацией изображения и синхронизацией кадров. Эта установка демонстрируется визуализацией одиночных молекул кинезина, идущих по динамическим микротрубочкам.
Introduction
Тотальная внутренняя флуоресцентная (TIRF) микроскопия обычно используется для визуализации одиночных флуоресцентных молекул. По сравнению с эпифлуоресцентной визуализацией, TIRF достигает превосходного подавления фона, что позволяет локализовать высокое разрешение и отслеживать одиночные флуорофоры. По этой причине TIRF является предпочтительным методом визуализации флуоресцентно меченых микротрубочек-ассоциированных белков и часто используется для изображения микротрубочек 1,2.
Чтобы исследовать регуляцию динамики микротрубочек с помощью MAP, часто необходимо одновременно получать изображения как микротрубочек, так и MAP. Большинство существующих методов для этой цели являются дорогостоящими или страдают техническими недостатками. Одновременная двухцветная TIRF, например, требует двух лазеров возбуждения и двух камер. В дополнение к высокой стоимости, потребность в отдельных камерах создает проблемы синхронизации кадров и регистрации изображений. Эту необходимость можно обойти, если вращающийся куб фильтра используется для физического переключения между лазерами возбуждения в последовательных кадрах3. В такой установке может использоваться один чип камеры, а кадры чередуются между изображениями микротрубочек и MAP. Этот метод, однако, ограничен скоростью смены фильтра, которая обычно ограничивает частоту кадров до менее чем 0,5 кадров в секунду3 (fps). Такая частота кадров недостаточна для разрешения быстрых динамических процессов, таких как усадка микротрубочки, происходящая со скоростью до 500 нм/с, ходьба кинезина со скоростью порядка 800 нм/с или диффузия MAP, происходящая с коэффициентами диффузии, превышающими 0,3 мкм2/с4. Это особенно проблематично при отслеживании относительных положений двух движущихся целей в каждом канале, таких как положение MAP относительно положения движущейся микротрубочкинаконечника 5.
В дополнение к этим оптическим ограничениям двухцветная микроскопия TIRF требует, чтобы MAP и микротрубочки были помечены различными флуорофорами, спектры излучения которых достаточно разделены. Флуоресцентная маркировка тубулина может изменять динамику микротрубочек6, а фотоотбеливание флуорофоров ограничивает скорость изображения7. Из-за этих проблем были разработаны методы визуализации без этикеток для визуализации микротрубочек. К ним относятся интерферометрическая микроскопия рассеяния (iSCAT)8,9, вращательно-когерентно-рассеивающая микроскопия (ROCS)10, пространственная световая интерференционная микроскопия (SLIM)11 и интерференционная отражательная микроскопия (IRM)12,13. Эти методы позволяют быстро визуализировать микротрубочки без меток без недостатков флуоресцентной визуализации, но они не могут быть использованы для визуализации отдельных MAP.
Из этих методов без этикеток IRM выделяется своей низкой стоимостью и скромными требованиями к приборам. Недавно мы представили протокол для объединения IRM с коммерческим микроскопом TIRF, позволяющий визуализировать микротрубочки и флуоресцентные MAP в чередующихся кадрах 3,13. В этом документе представлен протокол для изменения этой настройки для одновременной записи изображений TIRF и IRM на одном чипе камеры. Это включает в себя добавление недорогого светоделителя пучка в траекторию возбуждения для одновременного освещения образца лазером TIRF и светодиодным источником света IRM. Модифицированный коммерческий разветвитель изображений используется для спектрального разделения сигналов TIRF и IRM и проецирования их на отдельные половины одного и того же чипа камеры. Мы также используем микрофлюидную систему, которая позволяет быстро обмениваться реагентами во время визуализации. Этот протокол описывает, как эту установку можно использовать для изображения динамических микротрубочек и MAP. Возможности аппарата демонстрируются путем представления первой визуализации белков кинезина-1, идущих по усадочным микротрубочкам, которая захватывается с частотой кадров 10 с-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение регуляции динамики микротрубочек с помощью микротрубочек-ассоциированных белков (MAP) часто требует одновременной визуализации микротрубочек и MAP. Для этой цели обычно используются методы флуоресцентной микроскопии, такие как TIRF. Однако они ограничены недостатками флуоресцентной визуализации, которые включают фотоотбеливание, фотоповреждения и необходимость маркировки флуорофоров. Методы без меток, такие как IRM, подходят для визуализации микротрубочек, но не способны визуализировать одиночные флуорофоры. Этот протокол сочетает в себе IRM-визуализацию без меток и микроскопию TIRF для одновременной визуализации динамических микротрубочек и MAP.
Установка IRM использует светодиодный источник освещения, отфильтрованный до >600 нм, в то время как установка TIRF использует лазер 488 нм. Мы использовали недорогой пластинчатый разветвитель пучка для отражения света освещения на образец и передачи собранного сигнала на детектор (рисунок 1). Для минимизации потерь одномолекулярного сигнала был выбран светоделитель с 10% отражательной способностью и передачей 90%. 90% потери в интенсивности света освещенности компенсируются увеличением мощности подсветки лазера и светодиода.
Спектральное разделение сигналов было достигнуто с помощью светоделителя 90/10 (R/T) и двух спектральных фильтров (длинночастотные 600 нм для IRM и полосовые 535/50 нм для TIRF). Спектрально разделенные сигналы IRM и TIRF проецируются на две половины одного чипа камеры с помощью разветвителя изображения в сборе. Использование лучового разветвителя 90/10 жертвует 90% сигнала IRM, но это компенсируется увеличением интенсивности светодиодного источника освещения. Здесь также можно использовать дихроичное зеркало для более эффективного разделения сигналов IRM и TIRF. Флуоресцентные микрошарики, включенные в анализы, обеспечивают точное выравнивание изображений TIRF и IRM и служат ориентиром для фокусировки цели.
Наиболее важным оптическим элементом в этом протоколе является цель с высокой числовой апертурой (NA). Это важно не только для достижения полного внутреннего отражения, но и для максимизации эффективности коллекции и контрастности изображения. Качество получаемых изображений также зависит от чистоты поверхности стекла и получения четкого фонового изображения для коррекции на неравномерное освещение и удаления статических особенностей. Для визуализации IRM мы рекомендуем использовать длинноволновое освещение (>600 нм), чтобы свести к минимуму фотоповреждение микротрубочек и белков. Это особенно важно, если используется белый светодиодный источник света, и в этом случае должен быть включен фильтр длинных проходов для удаления любого ультрафиолетового света.
Этот протокол позволяет осуществлять высокоскоростную визуализацию динамических микротрубочек без меток и одновременную визуализацию с высоким разрешением флуоресцентных MAP17. По сравнению с методом переключения кубов фильтров, который чередуется между захватом изображений микротрубочек и MAP, эта настройка способна к гораздо более высокой частоте кадров, поскольку она не зависит от физического вращения куба фильтра. По сравнению с двухцветными методами визуализации TIRF, этот метод использует менее требовательную оптическую установку и обходит необходимость флуорофорной маркировки микротрубочек. Основные ограничения этой установки обусловлены тем, что TIRF получает изображения МАП; частота кадров ограничена временем экспозиции флуорофора, и фотоотбеливание флуорофоров остается возможным. Тем не менее, этот протокол улучшает существующие методы, поскольку он использует TIRF только в случае необходимости (т.е. для визуализации MAP, но не микротрубочек) и достигает максимально возможной скорости в пределах TIRF. Дальнейшие улучшения возможны только в том случае, если микротрубочки и MAP визуализируются с помощью интерферометрического метода, но для этого требуется маркировка MAP металлическими наночастицами, что имеет свои ограничения и экспериментальные проблемы.
Чтобы продемонстрировать возможности этой методики, мы одновременно визуализировали два быстрых динамических процесса с помощью IRM и TIRF: усадку микротрубочки и ходьбу флуоресцентной молекулы кинезина. Этот метод ранее использовался для визуализации быстрой диффузии спастина на уменьшающихся микротрубочках5. Помимо этого применения к MAP и микротрубочкам, этот протокол может быть использован для визуализации отдельных флуоресцентных молекул одновременно с любой макромолекулярной структурой, достаточно массивной для визуализации через IRM, такой как клеточная мембрана или актиновая нить.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим лабораторию Тьерри Эмоне за совместное использование оборудования для чистых помещений. Мы благодарим Инь-Вэй Куо за приготовление очищенного eGFP-кинезина, используемого в этом исследовании. Ю.Т. признает поддержку Фонда Александра фон Гумбольдта через Исследовательскую стипендию Федора Линена. Эта работа была поддержана грантом NIH R01 GM139337 (для J.H.).
Materials
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -. W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -. W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V., Astratov, V. . Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. , 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy). Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. Microfabrication in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
